Southern Blots 技术
互联网
853
<center> <p> </p> </center>
|
Southern Blot Flow 一 基因组酶切和电泳 在200 μl 微量离心管中加入： 25 μl DNA样品(约10μg)， 3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl） 5 μl 相应的10×buffer， 补水到50μl。 然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分，灌制0.8%的agrose胶，加入上样buffer后，在25―30V稳压电泳12―16hrs。 注意：在southern杂交中对，DNA的质量要求较高，否则酶切不完全导致失败。 二 转膜 1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色，大约需要15~30分钟。然后用水漂洗凝胶2~3次，将水倒尽，加入碱变性液，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要20~30分钟）。 注意：此方法对酶切后目标片段大于15kb时用，如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理，否则容易将片段打断，导致转膜后结合不紧密。 2 取一磁盘架上一洗净玻璃板，在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液，在玻璃板上架两层长滤纸（30cm左右）（注意不要产生气泡）搭成盐桥。（滤纸比胶弱宽）依胶大小裁好尼龙膜，写好标记，正面向下，紧贴于胶上，防止有气泡产生，接这压两张同样大小的滤纸，不可过大以免短路，胶周围用X光片压条。胶应反面朝上因为DNA多在胶的底层。堆积吸水纸。上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。 注意：防止短路 3 转膜16---20hrs后，将尼龙膜取下，胶染色，观察转膜效果。将膜用2xSSC浸泡20分钟，滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs（80℃）。待用。 三 杂交 ¨ 杂交炉与杂交管预热至65℃ ¨ 尼龙膜用2×SSC浸泡 配置杂交液 ssDNA沸水变性10min，冰浴10min，置冰浴备用 Components Volume (ml) Note ddH2O 20.7 50×Denhardts 0.6 P/H stock 8.1 20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6) Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热. Add prepared ssDNA （10mg/L） ≥0.3 ml 倒入杂交液，加入尼龙膜，65℃预杂交4~5小时（新膜） 注意：赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管，并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡，最后加入杂交液，盖好管盖。 四 探针标记 （for1~2 blots） ddH2O 7 ml Marker 1.5 ml 模板DNA 2 ml (about 100 ng) 沸水变性8min，冰浴10min，瞬时离心 Add Buffer+Primer 7.5 ml Add dNTPs(-dCTP) 3 ml Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml) 瞬时离心 Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot) 37℃ 水浴≥4小时 五 杂交 向标记探针的离心管中 Add 等体积TE 25 ml Add 10×体积变性剂（杂交液） 250 ml 沸水变性10min，冰浴10min，将变性好的探针加入到杂交液中，混匀，65℃杂交过夜（12~16小时）。 六 洗膜 1. 2×SSC,0.5%SDS 5min 2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT) 3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃) (洗膜过程中不断检测放射性强度直至200~500) 滤纸吸干洗液，保鲜膜包好，暗室中压片，根据放射性强度暴光若干天。 冲洗X光片。 说明： 由于做southern的整个过程比较复杂涉及到的试剂也比较多，我这里仅做了个简要的叙述，但基本的实验过程已列举出来了，此过程中的试剂可以根据具体的实验要求适当调整，如果各位有那里不清楚或者那些部分需要具体的介绍，请与我联系，我们共同讨论学习，另外，做杂交的过程中一定要注意防止同位素泄漏，做好个人的防护工作。 <center> </center> <center> </center> |
