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        Southern 印迹

        相关实验:Southern 印迹及基因组 DNA 杂交技术实验

        最新修订时间:

        原理

        硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强,当电泳后凝胶经过DNA变性处理,覆以上述滤膜,再于其上方压上多层干燥的吸水纸,借助它对深盐溶液的上吸作用,凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的,即DNA片段的位置保持不变。转移结束后,经过80℃烘烤的DNA,将原位地固定于膜上。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 7~20 μg 基因组 DNA 稀释到 500 μl 合适的限制性缓冲液中。4℃ 过夜。

        2. 每管加 10~20 单位限制性酶。孵育 4~6 小时。10 μl 消化液在小琼脂糖凝胶上电泳检测消化的程度。如果需要,就在消化液中补加酶。

        3. 用乙醇沉淀消化物:加 50 μl 3 mol/L NaOAc,混匀。然后加 1 ml 100 % 乙醇并混匀,在 -20℃ 至少放 30 分钟;或在干冰中放 10 分钟。离心 20 分钟(在离心机中定好管子的方向,这样你知道沉淀的位置)。去掉上清。

        4. 用 70% 乙醇洗一次:加 1 ml 70% 乙醇,离心 5 分钟。去掉上清。离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体。在空气中干燥 15 分钟。同时着手进行步骤 5.

        5. 0.7% 用 TAE 作为缓冲液的琼脂糖凝胶。凝胶中含溴化乙锭以避免在后面进行凝胶染色。


        Southern 印迹


        6. 用 TE ( pH 8 ) 重悬沉淀物。

        7. 慢慢地跑凝胶电泳;跑过夜或跑一整天(2.5 v/cm 凝胶长度可以允许凝胶跑过夜)。循环电泳缓冲液以避免形成 pH 梯度(缓冲液应该从阴极流到阳极)。

        8. 没有溴化乙锭的凝胶要染色 15 分钟(在 1 L 用过的 TAE 缓冲液中加 15 μl 10 mg/mI 溴化乙锭)。拍照以保存凝胶记录。

        9. 准备把凝胶转移到固相支持物上。

        (1) 传统方法

        ① 凝胶在 4~5 倍凝胶体积的 0.25 mol/L HCl 中孵育 15 分钟去嘌呤。

        ② 换 3 次变性溶液洗凝胶(每次用 3~4 倍凝胶体积),洗 1 小时以上。

        变性溶液(配 3 L):

        0.5 mol/L NaOH          60 g NaOH

        1.5 mol/L NaCl            261 g NaCl

        使用新鲜制备的溶液。

        ③ 换 3 次中和溶液中和(每次用 3~4 倍凝胶体积)1 小时以上。

        中和溶液(配 3 L):

        1 mol/L Tris                363 g Trizme 碱

        2 mol/L NaCl              350 g NaCl

                                         用 HCl 调 pH 到 6.5,约 100 ml

        贮存在室温。

        ④ 在 20 x SSC 溶液中进行转移。

        20x SSC 溶液(配 1 L):

        3 mol/L NaCl              175.3 g NaCl

        0.3 mol/L 柠檬酸钠      88.2 g 柠檬酸二氢钠

                                         pH 调到 7.0

        贮存在室温。

        (2) 碱转移法:只可以使用带正电荷的尼龙膜,用该方法硝酸纤维素会碎掉。

        ① 在 4~5 倍凝胶体积的 0.25 mol/L HCl 中孵育 15 分钟使凝胶去嘌呤。

        ② 组装毛细转移装置,20 x SSC 溶液换成 0.4 mol/L NaOH。

        ③ 在 0.4 mol/L NaOH(16 g/L)中进行转移。

        10. 按图所述组装毛细转移装置。

        Southern 印迹

        (1) 在组装转移装置前,把膜、滤纸和纸巾切成适当的大小。进行毛细转移时,液体必需在被纸巾堆吸收前通过膜。如果纸巾或滤纸接触到凝胶或滤纸条,就会发生“短路'这种情况。这种情况可以通过依次缩小膜、滤纸和纸巾的大小来避免。给出的尺寸是用于 20 cm x 20 cm 的凝胶。对于不同大小的凝胶要调整尺寸。

        Southern 印迹

        (2) 在 20 X SSC 溶液里打湿滤纸条(26 x 35 cm 滤纸)并把它铺在一块玻璃平板上使两端挂在盛有 1 L 20X SSC 溶液的平皿中。用一根玻璃吸管作为擀面杖,去掉任何玻璃和纸之间的空气泡。

        (3) 把凝胶放在滤纸条上。

        (4) 先在水中然后在 20 x SSC 溶液中把膜打湿,并把膜放到凝胶上面。用吸管代替擀面杖去掉任何空气泡。

        (5) 在 20 x SSC 溶液中打湿滤纸(18.5 x 18.5 cm ),放在膜上,确定要放在中间。用吸管作擀面杖去掉空气泡。

        (6) 把 1 堆纸巾放在滤纸上(中间)。

        (7) 盖一块玻璃或塑料板(如用干倒胶的托盘)并在上面压重物(例如一个放满液体的 500 ml 瓶子)。

        11. 至少进行 16 小时的转移。在拆除转移装置前,在孔的位置做上标记。

        12. 如果你使用的是传统方法,就用例如 Stratalinker 牌的紫外交联仪把 DNA 交联到膜上。如果你使用的是碱转移法,就不要作交联。

        13. 在 2x SSC溶液中洗膜。几分钟后,用你的手指(戴干净手套)轻轻地摩擦表面去掉所有黏附在滤膜上的琼脂糖。在杂交分析中,黏附在膜上的琼脂糖会造成很大的背景。

        14. 用水洗膜并把它保存在干净的纸巾之间,直至准备进行杂交分析操作。

        注意事项

        在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题:转膜必需充分,要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键。洗膜不充分会导致背景太深,洗膜过度又可能导致假阴性。若用到有毒物质,必需注意环保及安全。

        常见问题

        分子杂交是基因探测的基础,除了用印迹杂交外,还有斑点杂交法。即将DNA样品变性后直接点在硝酸纤维滤膜上,再与探针杂交,或者将细胞或病毒点在膜上,菌落或菌斑原位地吸附在膜上,经过变性处理,再进行杂交。斑点杂交多用于病原体基因,如微生物的基因,但也可用于检查人类基因组中的DNA序列。

        本实验来源《细胞实验指南》 黄培堂 等译。

        来源:丁香实验

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