• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        Western杂交

        互联网

        4536

         

        Western 杂交

         

        l      组织印迹的 Western 杂交

         

        在硝酸纤维素膜上制备组织印迹

        1. 在塑料板上放置两层 Whatman 1 号滤纸,在滤纸上方放上一张普通纸,然后铺上一层硝酸纤维素膜。

        2. 用双面刀片从植物组织如大豆的茎上切取一块切片(厚度约为 1mm )。如果组织表面是湿的,则在 Kimwipes 纸上轻轻吸干或用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用 Kimwipes 纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上,注意一旦将切片放置在膜上以后就不得再移动切片。在切片上放置 4 Kimwipes 纸,用手指轻轻压 15 20 秒,用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结构。

        3. 将留有组织印迹的硝酸纤维素膜在空气中晾干。

        4. 将留有印迹的膜面向下,放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中,对组织切片进行染色。 2 3 分钟后,吸干多余的染料,用间接照明立刻照相。将载玻片翻转,透过玻璃拍摄染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。

         

         

        用特定的抗体检测组织印迹中的蛋白质(室温下)

        1. 在浅碟子里倒入 30 40ml 洗涤缓冲液 I ,清洗留有印迹的硝酸纤维素 15 分钟。

        洗涤缓冲液 I

        0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)

        0.05% 叠氮化钠

        0.3 Twen-20

        2. 将膜转移到 15ml 印迹缓冲液中,培育 3 小时。

        3. 把膜转入 10ml 用印迹缓冲液稀释的初级抗体溶液中,培育 2 小时。

        4. 40ml 洗涤缓冲液 I 中清洗硝酸纤维素膜 10 分钟,换上新鲜缓冲液,重复清洗 3 次。

        5. 将膜转入 10ml 用印迹缓冲液稀释的与碱性磷酸酶结合的二级抗体溶液中,培育 1 小时。

        6. 40ml 洗涤液 I 中清洗硝酸纤维素膜 10 分钟。

        7. 40ml 洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜 15 分钟,换上新鲜缓冲液,重复清洗 1 次。

        洗涤缓冲液Ⅱ:

        0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)

        0.05% 叠氮化钠

        0.3% Tween-20

        0.05% 十二烷基硫酸钠

        8. 40ml 洗涤缓冲液 I 中清洗硝酸纤维素膜 10 分钟,然后用 AP 缓冲液平衡 10 分钟。

        AP 缓冲液

        0.1 mol/L Tris-HCl (pH9.5)

        0.1 mol/L NaCl

        5 mmol/L MgCl2

        9. 在显色反应中,将膜放入 10ml 含有 66 μ l 氯化硝酸蓝四唑和 33 μ l  5- -4- -3- 吲哚磷酸的 AP 缓冲液中,两者均为碱性磷酸酶底物。目的蛋白所在处将出现紫色。通常显色 10 分钟即可获得满意的结果。如果需要更长时间的显色反应,必须在黑暗中进行。

        10.  20ml 洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜 5 分钟,终止显色反应。用 40ml 蒸馏水洗涤 5 分钟后在空气中晾干。

        11.  在解剖显微镜观察组织印迹中被染上色的蛋白质。利用透射光和入射光可成功的观察到蛋白质的定位模式。在入射光下可容易观察到物理印迹。为了确认组织印迹中的蛋白质定位,建议将染色的组织印迹和用甲苯酸蓝染色的组织切片进行直接比较。

         

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序