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        Western Blot抗体杂交

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        孵育一抗

        A. 先将需要检测的抗体准备好,并决定好它们的稀释度。

        B. 配好5%的Milk(TBST溶解),按要求稀释好抗体。注意,如需高比例稀释,最好采用梯度稀释。

        C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时,可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。

        注意:为了便于后面分析结果,我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。

        洗涤

        用 TBST先快速洗三次,把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。

        洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合,洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

        孵育二抗

        孵育 RT1 小时。 一般采用HRP标记的二抗,稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低,否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种,要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗,以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD(葡萄糖氧化酶)酶链的二抗或者标志其他探针(如核素等)的。

        洗涤

        用 TBST先快速洗三次,把milk尽快的wash掉。 然后5mins *5。

        洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合,洗涤的效果直接影响结果背景的深浅,所以洗涤一定要干净。

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