基因文库中目的基因的筛选

 

克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因：
1. PCR 或RT-PCR 法
2. 从基因文库中分离基因
3. 从cDNA 文库中分离基因
4. 转座子标签法
5. 图位克隆法
6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法
7. 人工合成法
本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。
获的目的克隆的方法有两种
1 ） 目的基因的直接选择
2 ） 从基因文库中筛选
称为鸟枪射击法，建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆，从中筛选目的克隆。
一 、直接选择
　　直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。如克隆一个kan 抗性基因，在R6-5 质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan 抗性基因存在于13 个EcoRI 片段中的一段中。将R6-5 的片段插入pBR322 的EcoRI 位点中，连接混合物中将含有13 个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan 抗性的。只有含kan 的克隆才能在含有kan 的培养基上正常生长。
1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围
　　利用E. coli 的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli 中克隆trpA 基因，编码色氨酸合成酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。因此E. coli 的突变体可以用来克隆trpA 基因。首先从一个正常个体中提取总DNA ，然后酶切，连接产生大量重组DNA 分子，其中一个将携带完整的trpA 基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli 细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA 的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。

图5-1 直接选择法克隆Kan 抗性基因

1.2 标记援救的范围和限制
　　存在两个限制因素：
　　1 ） 必须存在着目的基因的突变品系
　　2 ） 需要一种只有野生型能够生长的培养基。
　　一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶，可以在基本培养上选择。

图5-2 标记拯救法克隆trpA 基因