激活的淋巴细胞内细胞因子的检测
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14 ．细胞内染色的标记荧光单抗试剂
依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记 IFN g -FITC/IL-4PE 与 CD3PerCP 组合是同时研究 TH1 与 TH2 型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用 BFA 等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。 BD 在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。
四、 激活
激活时由于 BFA 的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含 BFA 。激活过程在有盖的 Falcon 管中进行，所有试剂浓度都为在激活混合物中的终浓度。
1、 PMA+inonmycin(PMA+I)
a ．全血或 PBMCs 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释 ( 此稀释只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
b ． 25ng/mL PMA(25 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 1 m g/mL inonmycin(20 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 10 m g/mLBFA(20 m L 工作液 /mL 全血 ) 共刺激
c ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 小时孵育 ( 最好用培养箱，松盖，可控制 PH 值；若用水浴需旋紧盖子。 )
2、 SEB
a ．未稀释血用 10 m g/mLSEB 与 10 m g/mL BFA 刺激
b ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
3、 CD2/CD2R(BDIS Cat.No.340366)
a. 未稀释血用 20 m g/mL CD2/CD2R 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
4、 CD3
a. 稀释血用 CD3 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育。建议使用 CD5PerCP 或 CD45PerCP 作 FL3 标记，因为 CD3 抗原因与 CD3 交联而减弱。
注意：此 CD3 为高浓度低叠氮钠 CD3 ，不同于常用 CD3 ，需特殊定货。
5、 CD28
用 10 m g/mL CD28(BDIS Cat.No.550017) 可以增强 CD3 、 CD2/CD2R 、 SEB 等激活效应。
五、对照
正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。
1、 未刺激对照
未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与 10 m g/mLBFA 共孵育，不加刺激剂。
2、 同型对照
同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗 -KLH 同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
3、 激活对照
激活对照使用细胞表面表达 CD69 来评价激活与否。如果未达到 CD69 期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
a. 取部分血样加 PMA+I 但是不加 BFA( 抑分泌试剂如 BFA 会影响 CD69 表达，需去除以进行表面标志检测 ) 。
b. 表面染色 CD69PE/CD3PerCP ，省略通透与胞内染色步骤。
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，表面 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
4、 胞内染色对照
胞内染色对照通过胞内 CD69 染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于 90% 而胞内 CD69 未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。
a. 取部分血样加 PMA+I+BFA
b. 省略表面染色，胞内染色 CD69PE/CD3PerCP(BDIS Cat.No.340368)
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，胞内 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
六、染色
抗细胞因子抗体可以与细胞表面标志抗体联用以研究不同细胞亚群。 CD3PerCP ， CD4FITC ， CD8FITC 是 BDIS 研究 T 淋巴细胞亚群时最常用的组合。多数受试者的 CD4 ， CD14 ， CD56 抗原会因 PMA 的激活而有不同程度的下调 , 所以不适于 PMA 激活血样的亚群分析。通透后同时加入所有荧光标记抗体以便所有表位同时着色。表面染色试剂做胞内染色时需重新调试滴度以得到最佳结果。表面标志的胞内染色需与表面染色结果比较确定是否相当。 CD3 ， CD4 ， CD8 抗原既可在通透前表面染色也可在通透后胞内染色，但这并不适用于所有抗原，因为其表位对多聚甲醛敏感性不同。
表面染色
1 、加 BDIS 表面染色试剂 20 m L 于 Falcon 管中
2 、加 100 m L 稀释的 PMA+I 激活的全血或 50 m L 未稀释全血 ( 其他方式激活 ) 于表面染色试剂中 ( 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释的全血或 PBMCs 只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
3 、混匀，室温暗处孵育 15 分钟
通透与胞内染色
1 、加 2mL 1 × FACS 溶血素，室温暗处孵育 10 分钟。 PBMCs 或培养细胞染色时，加入 FACS 溶血素可以固定表面表位，优化通透过程。
注意： PMA 激活的全血可能会溶血不完全。
2 、离心 500g 5 分钟，弃上清，加 500 m L 1 × FACS 通透剂室温暗处孵育 10 分钟。
3 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清。
4 、加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育 30 分钟。
5 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清，加入 500 m L 1% PFA 。
注意：样本上机分析前可以在 4 ℃避光放置 24 小时。
七、分析
1 、应用 BD FACS 流式细胞仪分析。
2 、使用 CaliBRITE 标准微球， FACSComp(1.1 版本以上 ) 软件调节流式细胞仪 PMT 电压，荧光补偿，灵敏度。
3 、用 CellQuest 获取，用荧光或 FSC 设阈值，一般门内收集 10 ， 000 细胞。
4 、设门圈定 FL3+ 细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用 CellQuest ， Attractors 分析数据。 PMA 激活时，血小板可能会被圈在 FL3 门内，此时可以用 FSC/SSC 设门。以 CD4 设阈值时，以 FSC/SSC 设门可以排除单核细胞。
特异性结果的计算
问题及解答
图 4 、 TROUBLESHOOTING
14 ．细胞内染色的标记荧光单抗试剂
依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记 IFN g -FITC/IL-4PE 与 CD3PerCP 组合是同时研究 TH1 与 TH2 型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用 BFA 等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。 BD 在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。
四、 激活
激活时由于 BFA 的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含 BFA 。激活过程在有盖的 Falcon 管中进行，所有试剂浓度都为在激活混合物中的终浓度。
1、 PMA+inonmycin(PMA+I)
a ．全血或 PBMCs 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释 ( 此稀释只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
b ． 25ng/mL PMA(25 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 1 m g/mL inonmycin(20 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 10 m g/mLBFA(20 m L 工作液 /mL 全血 ) 共刺激
c ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 小时孵育 ( 最好用培养箱，松盖，可控制 PH 值；若用水浴需旋紧盖子。 )
2、 SEB
a ．未稀释血用 10 m g/mLSEB 与 10 m g/mL BFA 刺激
b ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
3、 CD2/CD2R(BDIS Cat.No.340366)
a. 未稀释血用 20 m g/mL CD2/CD2R 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
4、 CD3
a. 稀释血用 CD3 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育。建议使用 CD5PerCP 或 CD45PerCP 作 FL3 标记，因为 CD3 抗原因与 CD3 交联而减弱。
注意：此 CD3 为高浓度低叠氮钠 CD3 ，不同于常用 CD3 ，需特殊定货。
5、 CD28
用 10 m g/mL CD28(BDIS Cat.No.550017) 可以增强 CD3 、 CD2/CD2R 、 SEB 等激活效应。
五、对照
正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。
1、 未刺激对照
未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与 10 m g/mLBFA 共孵育，不加刺激剂。
2、 同型对照
同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗 -KLH 同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
3、 激活对照
激活对照使用细胞表面表达 CD69 来评价激活与否。如果未达到 CD69 期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
a. 取部分血样加 PMA+I 但是不加 BFA( 抑分泌试剂如 BFA 会影响 CD69 表达，需去除以进行表面标志检测 ) 。
b. 表面染色 CD69PE/CD3PerCP ，省略通透与胞内染色步骤。
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，表面 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
4、 胞内染色对照
胞内染色对照通过胞内 CD69 染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于 90% 而胞内 CD69 未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。
a. 取部分血样加 PMA+I+BFA
b. 省略表面染色，胞内染色 CD69PE/CD3PerCP(BDIS Cat.No.340368)
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，胞内 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
六、染色
抗细胞因子抗体可以与细胞表面标志抗体联用以研究不同细胞亚群。 CD3PerCP ， CD4FITC ， CD8FITC 是 BDIS 研究 T 淋巴细胞亚群时最常用的组合。多数受试者的 CD4 ， CD14 ， CD56 抗原会因 PMA 的激活而有不同程度的下调 , 所以不适于 PMA 激活血样的亚群分析。通透后同时加入所有荧光标记抗体以便所有表位同时着色。表面染色试剂做胞内染色时需重新调试滴度以得到最佳结果。表面标志的胞内染色需与表面染色结果比较确定是否相当。 CD3 ， CD4 ， CD8 抗原既可在通透前表面染色也可在通透后胞内染色，但这并不适用于所有抗原，因为其表位对多聚甲醛敏感性不同。
表面染色
1 、加 BDIS 表面染色试剂 20 m L 于 Falcon 管中
2 、加 100 m L 稀释的 PMA+I 激活的全血或 50 m L 未稀释全血 ( 其他方式激活 ) 于表面染色试剂中 ( 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释的全血或 PBMCs 只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
3 、混匀，室温暗处孵育 15 分钟
通透与胞内染色
1 、加 2mL 1 × FACS 溶血素，室温暗处孵育 10 分钟。 PBMCs 或培养细胞染色时，加入 FACS 溶血素可以固定表面表位，优化通透过程。
注意： PMA 激活的全血可能会溶血不完全。
2 、离心 500g 5 分钟，弃上清，加 500 m L 1 × FACS 通透剂室温暗处孵育 10 分钟。
3 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清。
4 、加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育 30 分钟。
5 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清，加入 500 m L 1% PFA 。
注意：样本上机分析前可以在 4 ℃避光放置 24 小时。
七、分析
1 、应用 BD FACS 流式细胞仪分析。
2 、使用 CaliBRITE 标准微球， FACSComp(1.1 版本以上 ) 软件调节流式细胞仪 PMT 电压，荧光补偿，灵敏度。
3 、用 CellQuest 获取，用荧光或 FSC 设阈值，一般门内收集 10 ， 000 细胞。
4 、设门圈定 FL3+ 细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用 CellQuest ， Attractors 分析数据。 PMA 激活时，血小板可能会被圈在 FL3 门内，此时可以用 FSC/SSC 设门。以 CD4 设阈值时，以 FSC/SSC 设门可以排除单核细胞。
特异性结果的计算
问题及解答
图 4 、 TROUBLESHOOTING
依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记 IFN g -FITC/IL-4PE 与 CD3PerCP 组合是同时研究 TH1 与 TH2 型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用 BFA 等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。 BD 在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。
四、 激活
激活时由于 BFA 的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含 BFA 。激活过程在有盖的 Falcon 管中进行，所有试剂浓度都为在激活混合物中的终浓度。
1、 PMA+inonmycin(PMA+I)
a ．全血或 PBMCs 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释 ( 此稀释只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
b ． 25ng/mL PMA(25 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 1 m g/mL inonmycin(20 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 10 m g/mLBFA(20 m L 工作液 /mL 全血 ) 共刺激
c ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 小时孵育 ( 最好用培养箱，松盖，可控制 PH 值；若用水浴需旋紧盖子。 )
2、 SEB
a ．未稀释血用 10 m g/mLSEB 与 10 m g/mL BFA 刺激
b ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
3、 CD2/CD2R(BDIS Cat.No.340366)
a. 未稀释血用 20 m g/mL CD2/CD2R 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
4、 CD3
a. 稀释血用 CD3 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育。建议使用 CD5PerCP 或 CD45PerCP 作 FL3 标记，因为 CD3 抗原因与 CD3 交联而减弱。
注意：此 CD3 为高浓度低叠氮钠 CD3 ，不同于常用 CD3 ，需特殊定货。
5、 CD28
用 10 m g/mL CD28(BDIS Cat.No.550017) 可以增强 CD3 、 CD2/CD2R 、 SEB 等激活效应。
五、对照
正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。
1、 未刺激对照
未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与 10 m g/mLBFA 共孵育，不加刺激剂。
2、 同型对照
同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗 -KLH 同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
3、 激活对照
激活对照使用细胞表面表达 CD69 来评价激活与否。如果未达到 CD69 期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
a. 取部分血样加 PMA+I 但是不加 BFA( 抑分泌试剂如 BFA 会影响 CD69 表达，需去除以进行表面标志检测 ) 。
b. 表面染色 CD69PE/CD3PerCP ，省略通透与胞内染色步骤。
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，表面 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
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图 2 、激活对照 |
图 3 、胞内染色对照 |
胞内染色对照通过胞内 CD69 染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于 90% 而胞内 CD69 未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。
a. 取部分血样加 PMA+I+BFA
b. 省略表面染色，胞内染色 CD69PE/CD3PerCP(BDIS Cat.No.340368)
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，胞内 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
六、染色
抗细胞因子抗体可以与细胞表面标志抗体联用以研究不同细胞亚群。 CD3PerCP ， CD4FITC ， CD8FITC 是 BDIS 研究 T 淋巴细胞亚群时最常用的组合。多数受试者的 CD4 ， CD14 ， CD56 抗原会因 PMA 的激活而有不同程度的下调 , 所以不适于 PMA 激活血样的亚群分析。通透后同时加入所有荧光标记抗体以便所有表位同时着色。表面染色试剂做胞内染色时需重新调试滴度以得到最佳结果。表面标志的胞内染色需与表面染色结果比较确定是否相当。 CD3 ， CD4 ， CD8 抗原既可在通透前表面染色也可在通透后胞内染色，但这并不适用于所有抗原，因为其表位对多聚甲醛敏感性不同。
表面染色
1 、加 BDIS 表面染色试剂 20 m L 于 Falcon 管中
2 、加 100 m L 稀释的 PMA+I 激活的全血或 50 m L 未稀释全血 ( 其他方式激活 ) 于表面染色试剂中 ( 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释的全血或 PBMCs 只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
3 、混匀，室温暗处孵育 15 分钟
通透与胞内染色
1 、加 2mL 1 × FACS 溶血素，室温暗处孵育 10 分钟。 PBMCs 或培养细胞染色时，加入 FACS 溶血素可以固定表面表位，优化通透过程。
注意： PMA 激活的全血可能会溶血不完全。
2 、离心 500g 5 分钟，弃上清，加 500 m L 1 × FACS 通透剂室温暗处孵育 10 分钟。
3 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清。
4 、加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育 30 分钟。
5 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清，加入 500 m L 1% PFA 。
注意：样本上机分析前可以在 4 ℃避光放置 24 小时。
七、分析
1 、应用 BD FACS 流式细胞仪分析。
2 、使用 CaliBRITE 标准微球， FACSComp(1.1 版本以上 ) 软件调节流式细胞仪 PMT 电压，荧光补偿，灵敏度。
3 、用 CellQuest 获取，用荧光或 FSC 设阈值，一般门内收集 10 ， 000 细胞。
4 、设门圈定 FL3+ 细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用 CellQuest ， Attractors 分析数据。 PMA 激活时，血小板可能会被圈在 FL3 门内，此时可以用 FSC/SSC 设门。以 CD4 设阈值时，以 FSC/SSC 设门可以排除单核细胞。
特异性结果的计算
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公式： |
(AS-AIC)-(US-UIC) |
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AS ： 激活样本 |
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AIC ：激活同型对照 |
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US ：未刺激样本 |
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UIC ：未刺激同型对照 |
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图 4 、 TROUBLESHOOTING
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问题 |
原因 |
解决 |
注释 |
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无 CD69 胞内染色 |
细胞未激活 |
激活剂制备不当，见激活剂制备储存一节。 |
PMA+I 激活后 4 小时 CD3+T 淋巴细胞 CD60 阳性率应 >90% |
|
使用了错误的抗凝剂 |
只使用肝素钠，不要使用肝素锂，避免使用 ACD 与 EDTA 等络合钙的抗凝剂。 |
淋巴细胞激活需要 Ca ，络合 Ca 的抗凝剂会影响激活。 |
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细胞未通透 |
在使用 FACS 通透液前先使用 FACS 溶血素 |
FACS 溶血素辅助细胞通透 |
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BFA 失活或制备不当 |
详见 BFA 制备 BFA 于 -20 ℃储存 |
详见 BFA 制备 |
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胞内染色阳性但很弱 |
抗细胞因子抗体浓度不对 |
按 BD 推荐量使用荧光抗体 |
正常的激活 T 淋巴细胞 IL-4 表达通常 <2% |
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通透后细胞在胞内染色前未洗 |
按操作程序通透后洗细胞在胞内染色 |
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背景染色太高 |
荧光单抗不纯或荧光与抗体结合不牢导致解析出的荧光染料非特异结合 |
使用 BDIS FastIMMUNE 试剂 |
BDIS 胞内同型对照专为胞内染色设计，配方与表面染色不同，可显著降低背景染色。胞内染色使用表面染色对照会导致高背景。 |
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抗体与固定后的胞内抗原亲和力低，需提高抗体浓度。 |
使用 BDIS FastIMMUNE 试剂 |
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错误的同型对照，对照 Ig 浓度过高 |
按 BD 推荐量使用 BDIS 匹配的同型对照试剂 |
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严重的细胞损失 |
洗涤离心步骤丢失细胞 |
固定通透的细胞离心 500g |
固定后细胞密度低于活细胞，需用高转速离心。 |
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加样步骤都市细胞 |
弃上清，不用真空吸样器 |
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溶血不完全 |
PMA+I 激活 |
按操作步骤用 FL3 做阈值去除岁片和未溶细胞 |
PMA 可稳定红细胞膜， PMA+I 激活全血较难溶 |
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FACS 溶血素或通透剂未用无离子水 1 ： 10 稀释 |
按操作步骤用无离子水 1 ： 10 稀释 FACS 溶血素或通透剂 |
FACS 溶血素或通透剂必须用无离子水 1 ： 10 稀释，用 PBS 会影响渗透性。此操作步骤不适用于其他通透剂。 |
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溶血未在室温进行 |
在室温进行溶血 |
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14 ．细胞内染色的标记荧光单抗试剂
依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记 IFN g -FITC/IL-4PE 与 CD3PerCP 组合是同时研究 TH1 与 TH2 型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用 BFA 等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。 BD 在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。
四、 激活
激活时由于 BFA 的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含 BFA 。激活过程在有盖的 Falcon 管中进行，所有试剂浓度都为在激活混合物中的终浓度。
1、 PMA+inonmycin(PMA+I)
a ．全血或 PBMCs 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释 ( 此稀释只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
b ． 25ng/mL PMA(25 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 1 m g/mL inonmycin(20 m L 工作液 /mL 全血 ) ， 10 m g/mLBFA(20 m L 工作液 /mL 全血 ) 共刺激
c ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 小时孵育 ( 最好用培养箱，松盖，可控制 PH 值；若用水浴需旋紧盖子。 )
2、 SEB
a ．未稀释血用 10 m g/mLSEB 与 10 m g/mL BFA 刺激
b ． 37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
3、 CD2/CD2R(BDIS Cat.No.340366)
a. 未稀释血用 20 m g/mL CD2/CD2R 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育
4、 CD3
a. 稀释血用 CD3 与 10 m g/mL BFA 刺激
b.37 ℃， 7%CO2 ， 4 ~ 6 小时孵育。建议使用 CD5PerCP 或 CD45PerCP 作 FL3 标记，因为 CD3 抗原因与 CD3 交联而减弱。
注意：此 CD3 为高浓度低叠氮钠 CD3 ，不同于常用 CD3 ，需特殊定货。
5、 CD28
用 10 m g/mL CD28(BDIS Cat.No.550017) 可以增强 CD3 、 CD2/CD2R 、 SEB 等激活效应。
五、对照
正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。
1、 未刺激对照
未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与 10 m g/mLBFA 共孵育，不加刺激剂。
2、 同型对照
同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗 -KLH 同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
3、 激活对照
激活对照使用细胞表面表达 CD69 来评价激活与否。如果未达到 CD69 期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
a. 取部分血样加 PMA+I 但是不加 BFA( 抑分泌试剂如 BFA 会影响 CD69 表达，需去除以进行表面标志检测 ) 。
b. 表面染色 CD69PE/CD3PerCP ，省略通透与胞内染色步骤。
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，表面 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
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图 2 、激活对照 |
图 3 、胞内染色对照 |
胞内染色对照通过胞内 CD69 染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于 90% 而胞内 CD69 未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。
a. 取部分血样加 PMA+I+BFA
b. 省略表面染色，胞内染色 CD69PE/CD3PerCP(BDIS Cat.No.340368)
c. 以 FL3 设阈值 CD3 设门检测 CD69 ，胞内 CD69 染色阳性率应在 90% 以上。
六、染色
抗细胞因子抗体可以与细胞表面标志抗体联用以研究不同细胞亚群。 CD3PerCP ， CD4FITC ， CD8FITC 是 BDIS 研究 T 淋巴细胞亚群时最常用的组合。多数受试者的 CD4 ， CD14 ， CD56 抗原会因 PMA 的激活而有不同程度的下调 , 所以不适于 PMA 激活血样的亚群分析。通透后同时加入所有荧光标记抗体以便所有表位同时着色。表面染色试剂做胞内染色时需重新调试滴度以得到最佳结果。表面标志的胞内染色需与表面染色结果比较确定是否相当。 CD3 ， CD4 ， CD8 抗原既可在通透前表面染色也可在通透后胞内染色，但这并不适用于所有抗原，因为其表位对多聚甲醛敏感性不同。
表面染色
1 、加 BDIS 表面染色试剂 20 m L 于 Falcon 管中
2 、加 100 m L 稀释的 PMA+I 激活的全血或 50 m L 未稀释全血 ( 其他方式激活 ) 于表面染色试剂中 ( 用无血清的 RPMI1640 1 ： 1 稀释的全血或 PBMCs 只适用 PMA+I 激活，细胞浓度 2 × 106 /mL 则无须稀释 )
3 、混匀，室温暗处孵育 15 分钟
通透与胞内染色
1 、加 2mL 1 × FACS 溶血素，室温暗处孵育 10 分钟。 PBMCs 或培养细胞染色时，加入 FACS 溶血素可以固定表面表位，优化通透过程。
注意： PMA 激活的全血可能会溶血不完全。
2 、离心 500g 5 分钟，弃上清，加 500 m L 1 × FACS 通透剂室温暗处孵育 10 分钟。
3 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清。
4 、加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育 30 分钟。
5 、加 2 ~ 3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清，加入 500 m L 1% PFA 。
注意：样本上机分析前可以在 4 ℃避光放置 24 小时。
七、分析
1 、应用 BD FACS 流式细胞仪分析。
2 、使用 CaliBRITE 标准微球， FACSComp(1.1 版本以上 ) 软件调节流式细胞仪 PMT 电压，荧光补偿，灵敏度。
3 、用 CellQuest 获取，用荧光或 FSC 设阈值，一般门内收集 10 ， 000 细胞。
4 、设门圈定 FL3+ 细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用 CellQuest ， Attractors 分析数据。 PMA 激活时，血小板可能会被圈在 FL3 门内，此时可以用 FSC/SSC 设门。以 CD4 设阈值时，以 FSC/SSC 设门可以排除单核细胞。
特异性结果的计算
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公式： |
(AS-AIC)-(US-UIC) |
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AS ： 激活样本 |
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AIC ：激活同型对照 |
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US ：未刺激样本 |
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UIC ：未刺激同型对照 |
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图 4 、 TROUBLESHOOTING
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问题 |
原因 |
解决 |
注释 |
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无 CD69 胞内染色 |
细胞未激活 |
激活剂制备不当，见激活剂制备储存一节。 |
PMA+I 激活后 4 小时 CD3+T 淋巴细胞 CD60 阳性率应 >90% |
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使用了错误的抗凝剂 |
只使用肝素钠，不要使用肝素锂，避免使用 ACD 与 EDTA 等络合钙的抗凝剂。 |
淋巴细胞激活需要 Ca ，络合 Ca 的抗凝剂会影响激活。 |
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细胞未通透 |
在使用 FACS 通透液前先使用 FACS 溶血素 |
FACS 溶血素辅助细胞通透 |
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BFA 失活或制备不当 |
详见 BFA 制备 BFA 于 -20 ℃储存 |
详见 BFA 制备 |
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胞内染色阳性但很弱 |
抗细胞因子抗体浓度不对 |
按 BD 推荐量使用荧光抗体 |
正常的激活 T 淋巴细胞 IL-4 表达通常 <2% |
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通透后细胞在胞内染色前未洗 |
按操作程序通透后洗细胞在胞内染色 |
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背景染色太高 |
荧光单抗不纯或荧光与抗体结合不牢导致解析出的荧光染料非特异结合 |
使用 BDIS FastIMMUNE 试剂 |
BDIS 胞内同型对照专为胞内染色设计，配方与表面染色不同，可显著降低背景染色。胞内染色使用表面染色对照会导致高背景。 |
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抗体与固定后的胞内抗原亲和力低，需提高抗体浓度。 |
使用 BDIS FastIMMUNE 试剂 |
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错误的同型对照，对照 Ig 浓度过高 |
按 BD 推荐量使用 BDIS 匹配的同型对照试剂 |
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严重的细胞损失 |
洗涤离心步骤丢失细胞 |
固定通透的细胞离心 500g |
固定后细胞密度低于活细胞，需用高转速离心。 |
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加样步骤都市细胞 |
弃上清，不用真空吸样器 |
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溶血不完全 |
PMA+I 激活 |
按操作步骤用 FL3 做阈值去除岁片和未溶细胞 |
PMA 可稳定红细胞膜， PMA+I 激活全血较难溶 |
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FACS 溶血素或通透剂未用无离子水 1 ： 10 稀释 |
按操作步骤用无离子水 1 ： 10 稀释 FACS 溶血素或通透剂 |
FACS 溶血素或通透剂必须用无离子水 1 ： 10 稀释，用 PBS 会影响渗透性。此操作步骤不适用于其他通透剂。 |
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溶血未在室温进行 |
在室温进行溶血 |
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