通过细胞计数对疾病模型小鼠进行免疫监测

互联网2013-09-06

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通过细胞计数对疾病模型小鼠进行免疫监测

摘要

生物样本往往是非单一细胞的混合物，如原代分离的细胞样本和许多培养的细胞样本都是由不同种类或不同功能的细胞组成。而对于样本中不同细胞亚群的区分和定量恰恰是很多研究中的关键一环。这些混合在一起的不同细胞通常是使用流式细胞仪和荧光标记的细胞类型特异性抗体来进行区分的。值得注意的是，许多细胞的类型和生理状态的鉴定不仅仅可以通过蛋白表达的变化来鉴别，也可以根据细胞大小的变化来区分。

对疾病模型小鼠的脾脏细胞进行检测，可以监测小鼠体内的免疫系统的变化，但脾脏细胞样本是比较复杂的多种细胞的混合物。本文以埃里希体病小鼠模型作为例子，对其脾脏细胞进行了流式细胞分析与 Scepter 细胞计数仪分析，并对比了检测结果，结果表明通过简化的细胞计数方法也能对疾病模型小鼠进行免疫监测。

前言

人类单核细胞埃里希体病（ Human Monocytotropic Ehrlichiosis ， HME ）是一种由蜱传播的急性病，由侵入单核噬菌细胞的病原菌 Ehrlichia chaffeensis 引起。 HME 初期出现像感冒一样的症状，但到后来可以发展成为有生命危险的中毒性休克症状，同时伴有贫血、血小板减少症和多种器官衰竭。 HME 不会导致病人体内很大的带菌量但却会出现广泛性的炎症，这种现象表明 HME 导致的死亡是由不受控制的免疫病理引发的结果 ^1,2 。本篇文献使用了感染 Ehrlichia muris 菌的 C57BL/6 小鼠作为 HME 小鼠模型，并研究此小鼠模型的免疫反应尤其是脾脏细胞亚群的变化动态。

实验材料和方法

小鼠感染 Ehrlichia muris 菌

6-8 周大的 C57BL/6 小鼠通过腹膜腔感染 Ehrlichia muris 菌。感染后第 30 天收集小鼠脾脏。脾脏样本使用 GentleMACS^TM 组织处理器形成单细胞悬液。

使用 Scepter 细胞计数仪检测脾脏细胞的分布

细胞稀释至合适的浓度（ ~1 – 2 x 10⁵ 细胞 /mL ）并上样到装有 40µm sensor 的 Scepter 细胞计数仪。未感染的小鼠脾脏细胞用于设定设门，以区分血红细胞。实验使用了 3 个未感染的小鼠的脾脏细胞样本和 3 个感染 Ehrlichia muris 菌的小鼠脾脏细胞样本。实验数据使用 Scepter Software Pro 软件进行分析。

使用流式细胞仪检测脾脏细胞的分布

脾脏细胞用检测细胞存活的荧光染料（ Near IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain kit ）在 PBS 缓冲液中避光室温孵育 10 分钟。细胞用 Fc Block^TM 和稀释在流式缓冲液（ PBS + 2% FBS + 0.09% 叠氮钠）中的兔子、大鼠和小鼠 IgG 进行清洗和封闭。然后细胞用荧光标记的细胞表面标志物抗体 B220 （ B 细胞）以及 Ter119 （红细胞）进行孵育及流式细胞分析。

结果

小鼠脾脏细胞的单细胞悬液使用多色流式细胞分析（图 1 ）。基于细胞大小的正向散射光区分确认了所有样本中均存在 2 个显著的细胞群体。使用对 B 细胞特异性的 B220 抗体和对红细胞特异性的 Ter-119 抗体进行染色表明，红细胞仅存在于较小细胞的亚群中，而含有较大细胞的亚群基本上由淋巴细胞组成。

流式细胞检测的直方图结果显示总细胞中一共有 3 个明显的亚群，包括碎片、淋巴细胞（较大的细胞）和红细胞（较小的细胞）。对 Ehrlichia 菌感染的小鼠脾细胞和阴性对照小鼠的脾细胞进行对比分析，结果显示在相对的细胞分布中出现了整体的迁移。具体来说，感染样本的红细胞亚群相对于白细胞亚群的比例上升了（图 2B 及表格 1 ）。与此结果相比较， Scepter 细胞计数仪的直方图结果能够检测到 2 个峰；相当于细胞碎片的第 3 个峰由于颗粒太小而低于检测的底线。虽然如此，但 Scepter 对脾脏细胞的总量以及对不同亚群比例的检测结果与流式细胞仪的检测结果非常一致。

对于感染小鼠的脾脏细胞浓度的整体评估，结果表明细胞亚群分布的变化是由于脾脏的红细胞亚群增加了，而淋巴细胞的值保持恒定（表格 2 ）。这些发现与以前发表的文献结果一致 ³ 。

结论

测评免疫系统对病毒、细菌、细胞和环境刺激的反应是对病原分析和毒性分析的一种重要的工具。用于鉴别细胞的活化状态和检测非单一细胞样本的细胞亚群的相对比例的简化方法，对于加速这些领域的科研是非常有用的。本篇文章中的数据显示， Guava easyCyte 流式细胞仪平台与 Scepter 细胞计数仪能从新鲜分离的原代细胞与培养的细胞样本中检测出这些变化。两种方法相比，流式分析系统是更复杂的定量工具， Scepter 则是一个更便捷的工具， Scepter 在细胞培养安全柜内就可使用并能很好地揭示不同刺激后细胞的反应，而且分析结果与现存的方法有很好的一致性。

Scepter 细胞计数仪结合了手持与自动计数的方便性以及库尔特原理计数的准确性。 Scepter 仪器能确保重复性很好的细胞计数，提高了实验设立过程和下游细胞分析实验的数据质量，为实验结果良好的重复性打下基础。

图 1. 细胞表面标志物鉴定小鼠脾脏细胞的亚群。正向散射光对比侧向散射光的图谱揭示存在着两个主要的脾细胞亚群。包含较大细胞的组分（图 A ）主要由淋巴细胞（ B 、 NK 、 T ）组成。而包含较小细胞的组分（图 B ）主要由红细胞组成（ Ter119+ ）。

图 2. 根据细胞大小对小鼠脾细胞分类。未处理的样本和被 Ehrlichia 感染的样本使用了流式细胞仪进行分析（ A, B ）以及 Scepter 细胞计数仪进行分析（ C ）。使用流式细胞仪可见 3 个显著的峰，分别对应于淋巴细胞，红细胞和细胞碎片。使用 Scepter 细胞计数仪可见 2 个显著的峰，对应于淋巴细胞和红细胞。细胞碎片的峰内颗粒大小低于 40µm sensor 的检测下限。

表格 1. 淋巴细胞和红细胞总的比例（ 6 个独立的脾脏细胞新鲜分离样本，其中 3 个对照样本， 3 个感染样本）。每个样本均用流式细胞仪和 Scepter 细胞计数仪进行分析。

表格 2. 所有 6 个样本的淋巴细胞和红细胞的总浓度。

参考文献：

Olano, J. P., G. Wen, H. M. Feng, J. W. McBride, and D. H. Walker. 2004. Histologic, Serologic, and Molecular Analysis of Persistent Ehrlichiosis in a Murine Model. Am. J. Pathol. 165:997–1006.
Paddock, C. D., and J. E. Childs. 2003. Ehrlichia chaffeensis: a Prototypical Emerging Pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 16:37–64.
MacNamara, K.C., Racine, R. Chatterjee, M., Borjesson, D, and Winslow, G.M. (2009) Diminished Hematopoietic Activity Associated with Alterations in Innate and Adaptive Immunity in a Mouse Model of Human Monocytic Ehrlichiosis. Infect. And Immunity. 77:4061-69.

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