哮喘大鼠模型的制作和T淋巴细胞的分离

互联网2013-09-06

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大鼠哮喘模型的分组及建立
实验大鼠分组：
根据随机化原则，将24只雄性Wistar大鼠（体重190-250g）按体重编号，采取随机排列表法分为以下4组：（1）正常对照组、（2）哮喘一周组（激发一周）、（3）哮喘两周组（激发二周）和（4）哮喘四周组（激发四周及以上）。
哮喘模型的建立：
第一天三组哮喘组大鼠每只大腿内侧皮下注射OVA悬液1ml（OVA10mg+氢氧化铝200mg+0.9%生理盐水至1ml），同时腹腔内注射灭活百日咳杆菌悬液1ml （约undefined109个菌株）作为佐剂,第8天重复致敏一次，第15天开始将大鼠置于自制玻璃容器中，隔日用402超声雾化器（上海四菱医疗器械厂）给于中等雾量的2%的OVA悬液50ml激发30分钟，每周至少3次，分别按分组激发1周、2周和4周及以上。OVA悬液激发后以大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快、行动迟缓或俯伏不动等症状以及肺内组织病理切片显示嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润，小气道和小血管收缩为哮喘激发成功。
正常对照组腹腔内注射等量PBS1ml代替OVA悬液,2周后雾化吸入中等雾量的PBS液50ml共30min,每天一次，共15天。
T 淋巴细胞的分离及体外培养
对各组大鼠无菌操作行肠系膜下静脉穿刺采血10ml,分装于离心管后用等量PBS液稀释，然后缓慢加于等体积的淋巴细胞分离液上，使形成层次分明的界面。
2200rpm离心20分钟，可见层次分明的界面。吸出离心管中间的一层乳白色的液体，加入0.85%的氯化铵以破碎红细胞并室温静置2分钟，然后用PBS终止反应。室温1800rpm离心10分钟，去除上清。
继续用PBS稀释液先后洗涤2次，每次1600rpm离心15分钟；
去除上清后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将沉淀调至1ml并轻轻吹打混匀，置37℃，5%CO2 温箱孵育1小时；
将细胞悬液进一步用无菌尼龙棉柱37℃，5%CO2 温箱培养1小时，分离出T细胞，台盼兰染色试验活细胞〉90%；
用含10%FBS的RPMI-1640培养液调整T细胞浓度为undefined106/ml,接种于24孔培养板内，每孔各1ml,于5%CO2、37℃培养箱内培养。

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