高效液相色谱法测定脂溶性维生素

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一、实验目的
1.熟悉高效液相色谱的原理及分析方法。
2.掌握高效液相测定脂溶性维生素的方法。
二、实验原埋
样品中的维生素A 及维生素E 经皂化处理后，将其不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A 和维生素E 分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。该法最小检出量分别为：VA：0.8ng ；α-E：9l.8ng ；γ-E：36.6ng ；δ-E：20.6ng.
三、仪器和试剂
仪器
高压液相色谱仪 带紫外分光检测器、旋转蒸发器、高速离心机；小离心管：具塑料盖1.5~3.0mL塑料离心管(与高速离心机配套)、高纯氮气、恒温水浴锅、紫外分光光度计。
2.试剂
实验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。
1.无水乙醚：重蒸，不含有过氧化物。
过氧化物检查方法：用5mL 乙醚加1mL 10%碘化钾溶液，振摇1min。如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。
去除过氧化物的方法：瓶中放人纯铁丝或铁沫少许，重蒸乙醚。弃去10%初馏液和10%残馏液。
2.无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质。
检查方法：取2mL 银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数
滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。
脱醛方法：将2g 硝酸银溶于少量水中，4g 氢氧化钠溶于温乙醇中，然后将两者倾入1L 乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时．硝酸银用量适当增加。
3.无水硫酸钠。
4.甲醇：色谱纯或分析纯重蒸后使用。
5.重蒸水：蒸馏水中加少量高锰酸钾，临用前重蒸。
6.10%抗坏血酸溶液(W/V)：临用前配制。
7.50%氢氧化钾溶液(W/V)
8.维生素A 标准液：视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A 标准品，使其浓度大约为1mL 相当于1mg 视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度.
9.维生素E 标准液: α-生育酚(纯度95%)，γ-生育酚(95%)，δ-生育酚(纯度95%)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E 标准品，使其浓度大约为1mg/mL。临用前用紫外分光光度分别标定此三种维生素E 的准确浓度。
10.内标溶液：称取苯并