粘多糖－肝素钠效价的测定

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一、实验目的
1.加深了解熟悉粘多糖的化学性质。
2.掌握肝钠素的测定原理和方法。
二、实验原理
肝素是一种粘多糖，其多肽链带有许多阴离子基团，如羧基、磺酸基等，使肝素具有强的负电荷性，能与阳离子和带正电荷的分子 结合成复合物。肝素可以与Na+结合生成肝素钠，具有抗血凝功能。其功能性效价的测定有两种方法：生物鉴定法和天青A 比色法。本实验采用后一种方法对肝素钠效价的测定。
碱性染料天青A 的正电荷与肝素磺酸基、羧基负电荷结合，生成肝素－天青复合物，其颜色不同于原来的颜色，在pH8.6条件下，于505nm 处可进行比色测定。天青A 比色法操作简单，重复性好，适于粗制品的快速测定。
三、仪器和试剂
仪器
722型分光光度计 、分析天平、pH 计、容量瓶、移液管、试管等。
试剂
1.巴比妥缓冲液：称取4.12g 巴比妥钠，加蒸馏水到500mL，再加19mL0.2mol/L 盐酸，混匀后制成pH8.6的缓冲液。冰箱保存待用。
2.肝素标准液：准确称取一定量的肝素标准品，用蒸馏水配成100单位/mL，冰箱保存。测定时，取2.5mL 稀释到250mL，成为1单位/mL。
3.天青A 溶液：称取0.5g 天青A，先用少量蒸馏水使其完全溶解，再用水定溶到500mL，冰箱保存。临用前取5mL，蒸馏水稀释到25mL，混均，测定用。
四、操作步骤
(一)标准曲线的制作
取12支15mL 的试管，编号后按下表配比依次加样并作平行管。
加完样品、试剂后立即摇匀，于722分光光度计上测定A505，以0号管作空白对照。以肝素钠效价为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(二)样品测定
精确称取10～15g 待测样品，先用少量蒸馏水使其完全溶解，再加水使成1mg/mL 溶液。取2.5mL，蒸馏水稀释到250mL，混均，使成1mg/100mL 的测定液。吸取0.2～1.2mL 测定液，加水补足至2mL，依次加入巴比妥缓冲液2mL，天青A 溶液0.5mL，摇匀于722分光光度计上测定A505。
五、计算
从标准曲线上查相应的效价，并按下式计算样品的效价。
样品的效价 ＝ P1×V/V1×Sw
P1—待测样品A505在标准曲线上所对应的效价单位数；
V—待测样品总体积(mL)；
V1—测定时所用待测液体积(mL)；
Sw—待测样品称取量(mg)。