种子蛋白质系统分析:种子蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

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一、目的：
谷物是人类特别是发展中国家人民的主要蛋白质来源，谷物中蛋白质含量是衡量其品质和营养价值的最重要的指标。培育高蛋白谷物品种，是广大育种工作者的奋斗目标。
对现有谷物进行评价、利用，对大批原始材料（种质资源）及育成品系进行品质筛选，都需要测定种子蛋白质含量。测定种子蛋白质含量的方法很多，一般可分为间接方法和直接方法两大类。凯氏定氮法是间接方法中的一种，国际谷物化学协会（ICC）、美国分析化学协会 ( AOAC）、美国谷物化学协会（AACC）等及不少国家都把凯氏定氮法定为标准法。通过本实验学习凯氏定氮法的原理，掌握样品的处理和自动凯氏定氮仪的操作。

二、原理
根据蛋白质的含氮量比较恒定，平均约为16% ，通过测定样品的含氮量进而推算蛋白质的含量。种子中的氮化物可分为蛋白氮和非蛋白氮。用三氯乙酸溶出种子粉或脱脂种子粉中的非蛋白氮化物（氨基酸、酞胺和无机氮），沉淀样品中的蛋白质并使二者分离。在催化剂参与下，用浓硫酸消煮分解样品，使蛋白氮转化为氨态氮，并与硫酸结合生成硫酸按。加碱蒸馏，使氨释放出来并吸收于一定量的硼酸中，再用标准酸滴定，求出样品中氮含量，乘以16％的倒数6.25 即可换算成蛋白质含量。

三、仪器、试剂和材料
1．仪器
( 1 )分析天平
( 2 )消化护
( 3 )消化管4 支
( 4 )具塞三角瓶100ml x2
( 5 )康氏振荡机1 台
( 6 )漏斗2 个
( 7 )吸管10ml X 1, 5mlX 1
( 8 )自动凯氏定氮仪（VS-KT-P 型）
2．试荆
( 1 ) 5％三氯乙酸
( 2）浓硫酸
( 3）混合催化剂硫酸铜：硫酸钾＝1 : 4 ( W / W )
( 4 ) 40％氢氧化钠
( 5 ) 4％硼酸
( 6 ) =0.05mol / L 标准硫酸
( 7）混合指示剂 50ml0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中。
四、操作步骤
( 1）用分析天平称取谷物全粉0.1000g 二份，分别加入2 只l00ml 具塞三角瓶中。
( 2）在三角瓶中加5％三氯乙酸20ml，置康氏振荡机上振荡提取（非蛋白氮化物）lh ，过滤，弃滤液。用5％三氯乙酸洗涤滤纸上的沉淀，最后将漏斗里的沉淀连同滤纸一起放入 1、2 号消化管内，在3、4 号消化管内各加1 张相同滤纸，作为空白。
( 3）在1-4 号管内各加适量催化剂及5ml 浓硫酸。置消化炉上，200℃ 消化0 .5h，然后升温至400℃ 再消化0.5h 。消化液呈清亮、蓝绿色。
( 4）待消化液冷却后，用自动定氮仪进行蒸馏、滴定。仪器可自动打印出结果报告，也可根据仪器给出的标准硫酸消耗体积进行手工计算。
五、结果处理

六、注意事项消化样品时要注意安全，防止烫伤或损失样品。