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        种子蛋白质系统分析:种子蛋白质亚基分析(SDS

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        一、目的
        蛋白质分子有单链、双链和寡聚蛋白等组成形式,组成蛋白质分子的单条肽链又称亚基。通过对天然蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性蛋白的SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 的比较,可以研究种子蛋白质分子组成和结构。另外,SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定亚基分子质量的好方法。通过本实验,学习SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、技术和实际应用。

        二、原理
        用十二烷基硫酸钠(SDS)和还原剂(琉基乙醇或二硫苏糖醇)热处理蛋白质样品,蛋白质分子中的二硫键被还原,解离的亚基与SDS 发生1 : 1.4 的定量结合。SDS 使蛋白质亚基带上大量负电荷,掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。亚基的构象均呈长椭圆棒状,各种蛋白质亚基-SDS 复合物表现出相等的电荷密度。在电场中其迁移速率仅与亚基分子质量有关,因此,SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳 可以进行蛋白质亚基分离,并用来测量蛋白质亚基的分子质量。

        三、仪器、试剂和材料
        1.仪器
        ( 1)稳压稳流电泳仪
        ( 2)垂直板电泳槽
        ( 3)微量注射器
        ( 4)烧杯50ml X2
        ( 5)白瓷盘
        ( 6)脱色摇床
        ( 7)吸管0.5ml X 2 , 5mlx2 , 10mlx3
        ( 8)真空泵
        ( 9)台式高速离心机
        2.试剂
        ( 1 ) 2%琼脂2g 琼脂加电极缓冲液100 ml,水浴中溶化。
        ( 2)电极缓冲液Tris 6g , Gly28.8g , SDS 2g ,去离子水溶解后,用Hcl 调pH 值至8.3,水定容至2000ml 。
        ( 3 ) 30 % Aer Acr 30g,水溶后定容至100ml,过滤,冰箱中贮存备用。
        ( 4 ) 1 % Bis Bis 1g ,水溶后定容至100ml,过滤,冰箱中贮存。
        ( 5)分离胶缓冲液(1.5mol / L Tris , pH8.7 ) Ths 15.17g,适量水溶解,然后用lmol
        / L HCI 调pH 值至8.7,定容至100ml 。
        ( 6)浓缩胶缓冲液(0.5mol / L Tris-Hcl , pH6.8 ) Tris 6.06g ,适量水溶解,然后用 lmol / L HCI 调pH 值至6.8,定容至l00ml。
        ( 7 ) 10 % SDS SDS 1g,加水10ml 溶解。
        ( 8 ) 10%过硫酸铵1g 过硫酸铵,加水10ml 溶解,现用现配,冰箱中最多可贮存一周。
        ( 9 ) TEMED(四甲基乙二胺)4℃,棕色瓶中贮存。
        ( 10)样品缓冲液(pH8.0 ) Tris 6.05g,甘油50ml,巯基乙醇25ml,溴酚蓝0.5g ,SDS l0g,溶于水,用HCI 调PH 至8.0,定容至500ml。
        ( 11)脱色液 甲醇:乙酸:水=5 : 1 : 5(体积比)
        ( 12)染色液(0.25%考马斯亮蓝R250)1.00g 考马斯亮蓝R250,用脱色液400ml溶解,过滤备用。
        ( 13)低分子质量标准蛋白溶液,包括溶菌酶(MW = 14 400Da)大豆胰蛋白酶抑制剂(21 5000)、碳酸酐酶(310000)、卵白蛋白(450000)、牛血清白蛋白 (66 2000)、磷酸化酶B (92 5000)。用样品缓冲液配成2mg / ml 溶液,在沸水浴中加热3-4min,冷却后使用。

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