植物组织中DNA和RNA的提取和鉴定

互联网2013-09-06

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一、实验目的
①学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和操作方法。
②学习和掌握测定核酸含量的定糖法(苔黑酚法和二苯胺法)的原理及操作方法。
二、实验原理
核酸是生物体内的主要化学成分，核酸在生物体内主要以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要存在与在细胞核中，RNA主要存在于细胞质中。
用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质。再由有机溶剂如乙醇、乙醚等抽提，去除脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液(10%氯化钠溶液)和0.5mol/L高氯酸(70℃)分别提取DNA 和RNA。
由于核酸和脱氧核糖核酸有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比。因此可用定糖法来定性定量测定核酸。
① 核糖的测定：测定核糖的常用方法是苔黑酚法(3，5—二羟基甲苯，即Orcinol反应)。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5—二羟基甲苯在沸水水浴中加热10～20min后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3，5—二羟基甲苯作用生成绿色物质。
RNA+浓硫酸+ 绿色化合物
注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。
② 脱氧核糖的测定：测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-6-酮基戊醛，再与二苯胺作用产生蓝色物质。
DNA+少量浓硫酸或冰乙酸+ 蓝色物质
注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。
此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。
上述两种定糖的方法准确性较差，但快速简便，能鉴别DNA和RNA，是鉴定核酸、核苷酸的常用方法。
三、实验器材
① 恒温水浴
② 电炉
③ 布氏漏斗装置
④ 移液管
⑤ 烧杯
⑥ 量筒
⑦ 剪刀
⑧ 研体
四、材料和试剂
① 新鲜菜花
② 95%乙醇
③ 丙酮
④ 5%高氯酸溶液
⑤ 0.5mol/L三氯酸溶液
⑥ 10%氯化钠溶液
⑦ 标准RNA溶液(5mg/100mL)
⑧ 标准DNA(15mg/100ml)
⑨ 粗氯化钠
⑩ 海沙
⑪ 二苯胺试剂：将1g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，再加入2.75mL浓硫酸(置冰箱中可保存6个月。使用后，在室温下摇匀)。
⑫ 三氯化铁浓盐酸溶液：将2ml10%三氯化铁溶液(用FeCl3·6H20配制加入到)400mL浓盐酸中。
五、操作方法
1. 核酸的分离
①取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中。加入20mL 95%乙醇和少量诲砂，研磨
成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。
②向滤渣中加入20mL丙酮，搅拌均匀,抽滤，弃去滤液。
③再向滤渣中加人20mL丙酮，搅拌5min后抽滤(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。
④在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL 5%高氯酸溶液中搅拌抽滤弃去滤液。
⑤特滤渣悬浮于20mL 95%乙醇中，抽滤，弃去滤液。
⑧滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5min。抽滤至干.用力压滤渣尽量除去丙酮。
⑦将干燥的滤渣重新悬浮在40ml10%氯化钠溶液中，在沸水浴中加热15mln，放置、
冷却，抽滤至干，留滤液，并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。
⑧将滤渣重新悬浮在20mL 0.5mol儿高氯酸溶液中。加热到70℃。保温20 min
(恒温水浴)后抽滤。留滤液为提取物二。
2.DNA和RNA的定性鉴定
①二苯胺反应：按表1加入各种试剂，反应后观察现象井记录结果。
表1 二苯胺反应加入试剂

管号	1	2	3	4	5
蒸馏水/ml	1	-	-	-	-
DNA溶液/ml	-	1	-	-	-
RNA溶液/ml	-	-	1	-	-
提取物一/ml	-	-	-	1	-
提取物二/ml	-	-	-	-	1
二苯胺试剂/ml	2	2	2	2	2
放沸水浴中10min后的现象

②苔黑酚反应：按表2加入各种试剂，反应后观察现象井记录结果。
表2 苔黑酚反应加入试剂

管号	1	2	3	4	5
蒸馏水/ml	1	-	-	-	-
DNA溶液/ml	-	1	-	-	-
RNA溶液/ml	-	-	1	-	-
提取物一/ml	-	-	-	1	-
提取物二/ml	-	-	-	-	1
三氯化铁浓盐酸溶液/ml	2	2	2	2	2
苔黑酚乙醇溶液/ml	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
放沸水浴中10-20min后的现象