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        HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法)

        互联网

        3500
        酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

        一、戊二醛二步法

        1. 原理:
        戊二醛为一种双功能 试剂 ,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
        2   试剂 及器材:
        (1) 0.1MpH6.8磷酸缓冲盐水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49mL, 0.2M NaH2PO4 51mL,NaCl1.8克,加蒸馏水至200mL。
        (2) 1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50mL与PH6.8的PBS1mL混合。
        (3) 1MpH9.5碳酸盐缓冲液:取1M碳酸钠3mL与1M碳酸氢钠7mL混合。
        (4) 0.2M赖氨酸溶液:称赖氨酸29.2mg溶于0.01MpH9.5碳酸缓冲液1mL中。
        (5) 0.15MpH7.4 PBS及生理盐水。
        (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
        (7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
        (8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
        (9) HRP(RZ>3.0)。
        (10) SepHadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
        (11) 搅拌器,分光光度计, 离心机 。
        (12) 透析袋,大、小烧杯, 试管 ,吸管等。
        3. 标记步骤:
        (1) 称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
        (2) 反应后的酶溶液经SepHadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/1min,收集棕色流出液。如体积大于5mL,则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中,缓慢搅拌。
        (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5mL,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
        (4) 用1MpH9.5碳酸缓冲液0.25mL,继续搅拌3h。
        (5) 加0.2M赖氨酸0.25mL,混匀后,置室温2h。
        (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1h。
        (7) 3000rpm离心0.5h,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。
        (8) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15MpH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30min去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。
        4. 结果判定:
        (1) 定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定。
        (2) 定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1cm)。
        酶量(mg/mL)=OD403nm×0.4
        IgG量(mg/mL)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
        酶量(mg/mL)         IgG量(mg/mL )      酶量
        克分子比值= ————————   ÷  ———————— = ———— × 4
                         40000                160000             IgG量
        (3) 本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4%的酶与蛋白质结合。
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