酶标抗体制备技术条件及方法

一、酶标抗体的条件
 

1.  纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。

2.  特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。

3.  效价高 一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。

二、酶标记方法

1.  交联法

交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD_235nm/OD_280nm<3时，即为好的交联剂。

戊二醛交联法又分为一步法和二步法。

（1）一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：

①抗IgG-AKP的制备：将10 mg AKP溶于含有5mg抗IgG的1 mlPBS(0.01 Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2 h~3 h后，以0.01 Mol/L pH7.0 PBS液4 ℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4 ℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);

②抗IgG-HRP的制备：将12 mg HRP溶于含5 mg抗IgG的1 mlPBS(0.1 Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4 mL，置室温2 h~3 h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。

（2）二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10 mg的酶溶于0.2 ml含1.25%戊二醛的0.1 mol/L pH6.8 PBS中室温放置18 h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1 ml然后加入1 ml(含5 mg)的抗体溶液和1 ml 1 Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4 ℃冰箱放置24 h，加入0.1 ml 0.2 mol/L赖氨酸，置室温2 h，以0.15 Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步标记法：取HRP 10 mg溶于0.4 ml,0.25 Mol/L pH6.8 PBS液中或0.05 Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1 ml，37 ℃温育2 h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2 ml，2500 r/min离心沉淀10 min~15 min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4 ml~5 ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1 ml 0.05 Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5 ml~1 ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15 mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH₂PO₄，使近中性即可应用。

2.  氧化法

采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。

（1）氧化法操作过程如下：将5 mg HRP溶于新配制的1 ml 0.30 Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1 ml 0.04 Mol/L~0.08 Mol/L过碘酸钠(NaIO₄)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1 ml 0.16 Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1 h，使氧化反应中止，然后在4 ℃中对0.10 Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3 ml HRP-醛基溶液中，加入5 mg(溶于1 ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2 h~3 h，加入5 mg氢化硼钠(NaBH₄)，于4 ℃冰箱放置3 h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。

（2）改良过碘酸钠法：

①取5 mg HRP溶于0.5 ml双馏水中，加入新配制的0.06 Mol/L NaIO₄水溶液(10 ml双馏水+128 mg NaIO₄) 0.5 ml，混匀，置4 ℃ 30 min;

② 取出后加入0.16 Mol/L乙二醇水溶液(10 ml H₂O+0.09 ml乙二醇)0.5 ml，室温放置30min;

③加入含5 mg纯化抗体的水溶液1 ml，混匀，并装入透析袋，对0.05 Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6 h(或过夜)，使之结合;

④加入NaBH₄溶液(5 mg/ml)0.2 ml，混匀，置4 ℃ 2 h;

⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4 ℃ 30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02 Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4 ℃透析除盐过夜;

⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物，以0.02 Mol/L pH 7.4 PBS液加至5 ml;

⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。