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        WESTERN BLOT PROTOCOLS

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        Western Blot技术专题

        蛋白提取与溶液配制

        溶液配制:

        RIPA Lysis Buffer (1L)

        Triton-X100 10ml

        SDS 1g

        NaCI 8.77g

        Tris HCI 2.42g

        Deoxycholatic Acid 5g

        四种抑制剂:

        1、Aprotinin(抑肽酶)

        2、PMSF

        3、Pepstation

        4、Leupeptin(亮抑蛋白酶肽)

        提取方法:

        1、配制裂解液:10ml RIPA 加入四种抑制剂(按要求稀释)

        2、加裂解液60µl,低温刮净细胞,抽打数次。

        3、4℃离心,14000g,20min

        样本收集后-20℃保存

        蛋白浓度测定BSA 标准曲线绘制:

        1、配制不同浓度的蛋白液浓度分别为:1000µg/ml、750µg/ml、500µg/ml、250µg/ml、50µg/ml五个点。具体方法:

        A、1000µg/ml 母液配好4℃存放,用时稀释相应浓度

        B、750µg/ml 取75µl母液加双蒸水至100µl

        C、500µg/ml 取50µl母液加双蒸水至100µl

        D、250µg/ml 取25µl母液加双蒸水至100µl

        E、50µg/ml 取5µl 母液加双蒸水至100µl

        2、取12 x 75试管,加双蒸水18µl做为空白对照,加2µl Triton-100(1%)共20µl

        3、取标准品18微升,加2µl Triton-100(1%)共20µl

        4、取样品5µl,加2µl Tritonx-100(1%),加水补足到20µl

        4、向各管中加1ml考马斯兰,混匀,2-5min,测定波长595nm的光吸收值A595

        5、用标准蛋白量浓度为横坐标,A595值为纵坐标,作图

        6、测样品(3.6倍)

        注:测蛋白标准品时由低浓度开始向高浓度测量

        Westen Blot

        溶液配制:

        1、5×电泳缓冲液 (1L)

        Tris碱 15.1 g

        Gly 94g

        10% SDS 50ml

        加蒸馏水定容1L(pH 7.2)

        工作浓度1× ,即取200ml ,定容1L 即可

        2、10×TBS (Tris Buffer Salt,pH 7.6,1L)

        Tris 24.2 g

        NaCl 80g

        加水800ml ,调pH 7.6 定容1L

        3、TBST (Tris Buffer Salt Tween20 ,1L)

        10×TBS 100ml

        Tween 1ml

        蒸馏水定容1L

        4、10×转膜液(1L)

        Tris碱 30.3g

        Gly (甘氨酸) 150.1g

        加水定容至1L

        用时取100 mL ,加甲醇200 mL ,在定容1L 即为1 ×

        5、4×Loading buffer

        0.5M Tris-HCl (pH 6.8) 2.5ml

        10% SDS 4.0ml

        甘油 2.6ml

        0.5%溴酚兰 0.4ml

        共9.5ml

        用时取950µl,中加入50µlβ-巯基乙醇 。

        6、丽春红染色液

        取丽春红0.5g,用去离子水 溶解后,加冰乙酸1ml,去离子水定容至100ml。

        7、抗体稀释液

        10%BSA贮存液配制:取BSA 1g ,溶于TBST 10ml 内。临用时取1ml原液,加9ml TBST。

        8、硝酸纤维素膜洗脱液

        100mM 2-巯基乙醇、2% SDS、62.5mM Tris-Cl(pH 6.7) 混合

        方法:

        1、制胶

        将两玻璃板底面在桌面对齐,后夹好,检查玻璃板间是否漏水,用滤纸擦干玻璃板

        开始制下层胶

        dd H2O 1.7 ml

        30% 丙烯酰胺 2.0 ml

        Gel Buffer 1.25 ml ( 1.5M Tris-HCl,pH 8.8)

        10% SDS 0.05 ml

        10% APS 25µl (引发剂)

        TEMED 2.5µl (催化剂)

        摇匀,立即用1ml 枪头加入玻璃间,后加150µl正丁醇消泡(,待胶和正丁醇间析出水后(凝胶标志,15-30min),用水冲净正丁醇。

        注:正丁醇要均匀加入各个部位,防治由于正丁醇不匀,导致下层胶不平

        下层胶高度应距梳子下端大约1cm (由于胶回缩,所以实际应小于1cm)

        制备上层胶

        dd H2O 1.7 ml

        30% 丙烯酰胺 2.0 ml

        Gel Buffer 1.25 ml ( 0.5M Tris-HCl,pH 6.8)

        10% SDS 0.05 ml

        10% APS 25µl

        TEMED 2.5µl

        现在每侧加1ml,然后插梳子,再将剩余的胶加入,胶的上缘约与梳子平齐,5-10min水平向上缓慢拔梳子,注意防止损坏泳道。拔下梳子后,用电泳液冲洗泳道。

        2、上样

        2.1将蛋白样品加好Lading Dye后,将蛋白变性,即:将蛋白样品在95℃ 5min(注意待温度达到95℃时,才将样品加热,禁止缓慢加热) ,后立即冰上4-5min , 准备上样。

        2.2插好玻璃板,注意短玻璃向内,放置在电泳槽 内。

        2.3先加好电泳液1×Running Buffer ,水位到两个玻璃之间。

        2.4将样品(根据先前计算大约需要40µg样品蛋白需加量,及Lading Dye共10µl)和蛋白分子量marker 4µl加入孔道。

        3、电泳

        打开电源,电压100v ,样品出孔后,呈水平线是加大电压130-150v ,待跑至两个螺丝底部之间连线停止电泳。总计约1h。

        4、电转膜

        4.1电泳结束后,取出胶,根据需要样品分子量,休整胶的大小(一般上面去掉上层胶,下面在染料的上缘切割并修整胶大小,形状,并量出大小,根据大小准备滤纸和NC膜。

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