Southern blot实验安排总结
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<center> <img alt="Southern blot实验安排总结" height="262" src="http://ts1.cn.mm.bing.net/th?id=H.4758919165511564&pid=1.7" width="392" /></center> Southern blot 实验安排
酶切及转膜：
第一天晚上：
酶切过夜
第二天：
跑电泳，看酶切效果。50V，6小时。转移过夜。
同时准备吸水纸、Watmamm 3mm的滤纸、尼龙膜、磁盘、玻璃板、
剪刀、钝头镊子、铅笔、小的饭盒
配置试剂：
20×SSC：
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
溶于800ml水中，调PH值至7.0，定容至1L，灭菌。
20%SDS
在400ml中加入100gSDS，定容至500ml。
变性液缓冲液
0.4mol/L NaOH
将12.8g NaOH溶于水中，定容至800ml。
2×SSC
将10ml20×SSC溶于水中，定容至100ml。
0.5×SSC/0.5%SDS
2.5ml 20×SSC和2.5mlSDS溶于水中，定容至100ml。
1M phosphate Buffer PH6.8
1M Na2PO4(FW 142) 1M NaH2PO4(FW120)
称：0.1L×1M×142=14.2g 0.15L×1M×120=18g
溶于水中，定容至100ml。 溶于水中，定容至150ml。
最后按Na2PO4：NaH2PO4=46.3：53.7=92.6ml：107.4ml 配200ml
第三天：
将尼龙膜用2×SSC 将但润洗，再用煮沸的0.5×SSC/0.5%SDS漂洗两次至溴酚蓝颜色消失。置于湿润的滤纸上，结合有DNA的一面向上，微波炉内烘烤至滤纸与膜自然分离(约2分钟)。膜用保鲜膜包裹后存在4度待用。
杂交过程实验安排：
前一天领钥匙，登记。
第一天：
预杂交及杂交液：
(注：BSA 要求新鲜配置，要先溶解后混合，不然很难溶解)
配50ml
1%BSA 0.5g(先加5mlddH2O溶解)
7%SDS 20%SDS17.5ml
0.5M Phosphate buffer 1M：25ml
1mM EDTA 0.5M：100µl
鲑鱼精DNA 100µg/µl 10mg/ml：50µl
ddH2O溶解至45ml，与5ml 1%BSA混合，定容至50ml水中。
洗膜液I(磷酸系统) 100ml
BSA 0.5% 0.5g
EDTA 1mM 0.5M:200µl
NaHPO4(PH7.2) 40mM 1M:4ml
SDS 5% 20%:25ml
洗膜液II(磷酸系统) 100ml
EDTA 1mM 0.5M:200µl
NaHPO4(PH7.2) 40mM 1M:4ml
SDS 5% 20%:25ml
杂交：门卡、卫生纸、滤膜(预先剪好)、钥匙、同位素探测仪、报纸、剪刀、10小条封口膜、计时器、冰盒+冰、袖筒、垃圾袋、镊子(已有)、手套、多个浮板
洗膜：X光片夹、保鲜膜
注意:封口膜一定要先撕好了。
浮板尺寸要合适。
1、预杂交：
取膜，结合有DNA的一面朝下，放于预热的预杂交液中，65度4个小时。
2、探针标记：
(1) 在0.5ml离心管中加入下列试剂,95℃加热3分钟，迅速置于冰中，放置5分钟。
探针 8μl
Random Primer 2μl
dH2O 4μl
(2)加入10×Buffer，dNTPMixture 2.5μl,用于标记的dCTP 5μl。
(3)加入1μl Exo-free Klenow Fragment，37℃反应10分钟。
(4)65℃加热5分钟使酶失活。
(5)95℃加热3分钟迅速置于冰中冷却。
(6)取适量的反应液直接作为探针使用。
3、杂交
将标记好且已经变性的探针加入杂交液中，65度杂交14～16小时，间或摇动一下。
4、洗膜：
杂交完后，分别用洗膜液I室温下洗20分钟，洗膜液II室温下和65度各洗20分钟。洗完后稍微干燥晾干杂交膜(不可完全干燥)，用保鲜膜包裹后通过放射性探测器测量杂交信号的强弱，放于X光片夹中。
5、压片，洗片：
压片1～2天，先显后定。
蛋白SDS-PAGE电泳
原理：蛋白被变性和失去电荷后其迁移率只与蛋白分子量大小有关。
电泳仪：宁波新芝科器研究所MV-II型双垂直拟电泳槽
试剂配制：
清洗玻璃板：先用蒸馏水冲洗，再用脱脂棉醮无水乙醇擦拭玻璃表面，晾干。
配置10%过硫酸铵溶液(APS)：称取0.1g过硫酸铵(Ammonium Persulfate)，加水至1ml。
事先配好的各项母液：10%(w/v)SDS 溶液：称取10克SDS，溶于100 ml蒸馏水，微热使溶解。
1%(v/v)TEMED溶液：取1 ml的TEMED(即N，N，N‘，N’-四甲基乙二胺)，稀 释至100ml。储存于深色瓶内，4℃保存。
10%过硫酸铵：(NH4)2S2O8(简称AP)1克溶于10 ml水，用前配制。
蛋白质样品处理液：(不连续系统)
a. 先配制0.5 M pH 8.0 的Tris-HCl buffer：0.61g Tris溶于50 mlddH2O，用1M 盐酸调pH。
b. 10% SDS溶液2 ml，
β-巯基乙醇 0.5 ml,
Sucrose 4 g,(or 甘油1 ml)
溴酚蓝 2 mg，
0.05M Tris-HCl buffer, 加水至总体积 10 ml (1×)
电极缓冲液：含0.1% SDS的0.05 M Tris-0.384 M Gly buffer, pH 8.3
6.0 g Tris
28.8 g Gly
10% SDS 10 ml , 加水稀释到1升
凝胶缓冲液：
a. 浓缩胶缓冲液：
0.5 M，pH 6.8 Tris-HCl buffer：
称取6.0 g Tris，加入50 ml 水溶解，用1M盐酸调pH，定容至100 ml。
b. 分离胶缓冲液：
1.5 M，pH8.8 Tris-HCl buffer：
称取18.2 gTris，用少量水溶解，加入盐酸25 ml，再用盐酸调pH，加水定容100 ml。
凝胶储备液：
a. 浓缩胶储备液：
10%丙烯酰胺- 0.5%甲叉双丙烯酰胺溶液：
10gAcr, 0.5g Bis, 溶于100ml水，滤去不溶物，储存于深色瓶中。
b. 分离胶储备液：
30%Acr–0.8%Bis溶液：
30g Acr , 0.8 g Bis, 溶于100ml水，过滤，储于深色瓶内。
分离胶的配制：按下述配方配制15ml，灌注9ml为佳。
SDS-PAGE 不连续垂直平板电泳：
试剂： 蛋白质标准Marker
10% (w/v)SDS 溶液
1% (v/v)TEMED溶液
10% 过硫酸铵
蛋白质样品处理液
电极缓冲液
凝胶缓冲液
凝胶储备液
SDS-不连续系统分离胶和浓缩胶的配制：
|
试剂名称 |
配制30 ml 不同浓度的分离胶所需的试剂量(ml) | 配制10ml5%浓缩胶所需试剂(ml) | ||||
| 7%分离胶 | 10%分离胶 | 12%分离胶 | 15%分离胶 | 20%分离胶 | ||
| 分离胶储备液 | 7 | 10 | 12 | 15 | 20 | |
| 分离胶缓冲液 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | |
| 浓缩胶储备液 | 5 | |||||
| 浓缩胶缓冲液 | 2.5 | |||||
| 10%SDS溶液 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.1 |
| 1%TEMED | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0.8 |
| 蒸馏水 | 13 | 10 | 8 | 5 | 1.5 | |
| 10%过硫酸铵 | 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 |
2. 浓缩胶的配制：按上述配方配制5ml，灌注2~3ml即可。
3. 电极缓冲液的配制：(5X，200ml)28.8g 甘氨酸，6.04g Tris, 10ml 10%SDS，pH应在8~9之间。
4. 染色液的配制：0.25%考马斯亮蓝R-250(COOMASSIE R250)，50%甲醇，7%乙酸水溶液。
5. 上样缓冲液：上样缓冲液也可用以下配方：浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS1.6ml、2-ME0.4ml、0.025%(W/V)溴酚蓝0.2ml、水4.0ml或浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml、2-ME0.4ml、0.025%(W/V)溴酚蓝0.2ml、水2.4ml。临用前加入2% 2-巯基乙醇(2-ME, 2-Mercaptoethanol)，Protein样品与上样缓冲液1:1混匀后100℃加热3~5分钟，降至室温后高速离心3分钟，取上清加样。每孔点样量以30ul为宜。
6. 电泳：1X电极缓冲液约400ml，电压100V，电流处在20~40mA之间，约3~4小时后电泳完毕。
7. 将玻璃板撬开后染色2~3小时，回收染色液。
8. 过夜脱色或脱色3~4小时，脱色液配方：7%乙酸，30%甲醇的水溶液。
9. 拍照处理或凝胶成象，记录结果。
10. 干胶：脱色后的凝胶用30%甲醇、7%乙酸、2~5%甘油的水溶液振荡处理1小时，取两张在水中浸泡过1分钟的醋酸纤维膜平铺于干胶器上，凝胶处于两膜之间，用玻璃棒滚动除去气泡，压上干胶框，四周夹上夹子，风干或干燥箱干燥24小时以上。
细胞核大片段DNA的提取方法
准备
1. 灭菌：3个500 ml烧杯，研钵，小钥匙，5 ml离心管，10 ml 离心管，5 ml枪头， 剪口1 ml 枪头;
2. 酒精处理：100 ml离心管，小铁铲，模具;
3. 清洗尼龙膜：洗干净SDS，小烧杯，玻璃棒;
4. 核分离缓冲液(NIB)，裂解Buffer，TE预冷;
5. 液氮， 10g 以上材料， 冰。
具体操作：
1. 在液氮中将材料研磨成粉末，尽量磨碎;
2. 在烧杯中加入核分离Buffer，预冷，按10ml/g加入;
3. 将粉末加入烧杯中，用玻璃棒轻轻搅匀，分散成块的粉末，冰上静置10 min;
4. 将混合物在单层大孔径尼龙膜上过滤：在液体滤过以后，带手套将尼龙膜卷起轻轻挤压，挤出残留液体;
5. 液体在双层尼龙膜上再过滤一次;
6. 加入1/20体积的核分离Buffer(含10% Triton)，轻轻搅匀，静置10 min：时间不能延长，Triton的量不能增加，否则易使核破裂;
7. 4000 rpm离心10 min，小心倒尽上清：上清中可能还带有白色颗粒状的悬浮物，这是Triton与蛋白的结合物;
8. 加入50 ml核分离Buffer，重新悬浮沉淀，4000 rpm离心10 min;
9. 加入50 ml NIB，悬浮沉淀， 4000 rpm 离心10 min;
10. 配制1-1.2%低熔点琼脂糖(LMT agarose)
11. 尽量除去上清，将混合物置于42℃中平衡，在沉淀混合物中加入等体积的LMT agarose(65℃) 小心用剪口1 ml枪头混匀，将混合物注入模具中(模具预冷)，要快，否则会凝固于管中;
12. 配制裂解Buffer
13. 将包埋成块推出，浸入裂解Buffer，置于50℃，24h后更换裂解Buffer，再置于50℃处理24h;
14.
|
100 ml：
1．TE（PH8.0）在冰上洗涤三次，每次20min； 2．含1 mM PMSF的50 ml TE（PH8.0）冰上洗涤1h 3．5 ml TE（PH8.0）存放于4℃ 3 |
1. 所有用具，器皿，溶液都要预冷;
2. 全部操作都要在冰上进行，除包埋块的浇注和核破裂的过程
3. 动作一定要轻柔而快速。
核分离Buffer
| 终浓度 | 母液 | 100 ml 所用量 | |
| Tris—HCl（PH9.5） | 10 mM | 1M | 1 ml |
| EDTA | 10 mM | 0.5M | 2ml |
| KCl | 100 mM | 1M | 10ul |
| Sucrose | 0.5M | 17.11g | |
| Spermidine 亚精胺 | 4mM | 0.2M | 2ml |
| Spermine 精胺 | 1.0mM | 0.1M | 1ml |
| Mercapto-ethanol 巯基乙醇 | 100ul | ||
| Triton X-100 | 10ml |
| 终浓度 | 母液 | 10ml | |
| Sarkosyl十二烷基肌氨酸钠 | 1% | 20% | 0.5ml |
| EDTA(PH 8.0) | 0.25M | 0.5M | 5ml |
| Proteinase K | 0.2mg/ml | 2mg |
【配制方法】
用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml(10mmol/L)，分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液(100mmol/L)。
【注意】
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性(pH>8.6)并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
