基本方案 Southern blot 杂交法检测基因扩增

相关实验：肿瘤中基因扩增的分子分析实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	肿瘤组织
试剂、试剂盒	1 X TNE 缓冲液亚精胺乙醇 6 X 上样缓冲液毛细试验溶液 20 X 和 60 X SSC HCl 20% SDS 绯精子DNA 双链 DNA 探针 NaCl 溶液 TE 缓冲液限制酶和相关的10 X 缓冲液牛血清白蛋白小牛胸腺 DNA 标准品
仪器、耗材	DNA 提取试剂盒 Nitrocellulose 膜大容积pipet 荧光计热封聚乙烯袋子离心管 UV cross-linker 7. 5 ml圆形玻璃匀浆器或等效物水浴装置毛细管钝头镊子 X-AR 放射自显影片子 Rocker 台 O 边的螺旋盖管真空泵装置

步骤

1. 用手术刀把一小片或多小片肿瘤组织切成小粒。往 7. 5m l圆形玻璃匀浆器加入几微升 DNA提取液然后把组织匀浆。对于血红细胞或骨髓样本，先把样本放在一80°C冻 1〜2h，然后进行匀浆。液体样本< 3 ml直接进行匀浆。 2.把匀浆转移到一 30m l离心管，加 DNA提取液至总体积为M m L 加入 62. 5卩 1 proriase (终浓度为lmg/ml)。 37°C孵育过夜。偶尔倒转离心管使溶液混勻。 3•冰上冷却离心管> l 〇 min。加入 5ml NaCl提取液并颠倒几次。 4°C 2000g 离心 20min。用以大容积的pipet把上清液转移到一 50m l离心管。不要转移任何沉淀。 4•加RNase至终浓度为20Mg/ml。轻轻地振荡离心管， 37°C ，孵育> 1 5 min。冰上冷却

离心管> l〇 min。加入2. 5 倍体积的冰冷的1 0 0 % 的乙醇并颠倒几次。看到 D N A 沉淀出现。为了提高D N A 的回收效率，一20°C 孵育> 2 0 min。 5 . 4 °C 2000g 离心20min。小心地倒掉乙醇。加人约25m l 7 0 % 的乙醇到 D N A 沉淀，轻轻地振荡。离心 l 〇 min。小心地倒掉 7 0 % 乙醇。室温下在 30mmHg真空泵或 Speedvac蒸发器中使样品干燥15min。 6. 加人 200〜2000^1 T E 缓冲液（根据D N A 沉淀的大小）到离心管以获得浓度为50〜 lOOjug/ml的 D N A 溶液（假设 IOOmg样本生成IOOjUg D N A ) 。把 D N A 转移到 2ml 或 5ml O 形边的螺旋盖管并在转鼓仪上混合15〜30min (或过夜）使沉淀溶解。如果过夜混合后沉淀没溶解就加入更多的T E 缓冲液。 4°C永久保存D N A 溶液，避免突光照射。 7 . 室温下把D N A 样品和小牛胸腺D N A 标准品在转鼓仪上孵育约15min。孵育的过程中，打开mini突光计的电源，预热> 1 5 min。 8. 往适当标记的0.5m l 微离心管（双份准备）加入 5jlJ 新鲜配制的毛细试验溶液和2^1 I X T N E 缓冲液。然后加入3^1 D N A 样本或小牛胸腺D N A 标准品到样本管或标准品管，另外加 I X T N E 缓冲液到空白的毛细试验管，离心，混勻后再离心。 9. 把各自试验溶液从离心管转移到IOjUl毛细管。用空白管对荧光计进行校正并调零，接着用lOOjug/m l 的小牛胸腺D N A 标准品把仪器校准到100。然后测定其他标准品和 D N A 样品的浓度（理想浓度为SOiU g M l 和 20(V g /ml乂对 >30(V g /m l 的样品，用 T E 缓冲液稀释并重新测定。差异 D N A 展示（备选方案 2 ) 应该用来分析 D N A 浓度 <ljug/ml或 D N A 总浓度 < 5 jug/m 丨的样品。 10•在I.5m l 离心管里准备下列的样本和对照水解液： 5 哗 D N A (样品，单拷贝对照或扩增的对照）； I. 2jul lm ol/L 亚精胺（终浓度为 4mm ol/L); 203jul无菌水。 11. 完全解冻并重悬I O X 限制酶缓冲液和lmg/m l 的 B S A 。如果缓冲液有沉淀， 65°C 短时孵育。加 30M1 I O X 缓冲液和3〇4 B S A 到每一个样品管和对照管。以最大的速度短时离心。振荡并重新短时离心。让 D N A 在缓冲液混合液中平衡几分钟。每管中加入 lO^ lOU/W 限制酶。短时离心。轻轻地振荡并根据操作手册的建议进行孵育。 12. 短时离心。每管加入3(^1 (1 /1 0 体积）4m ol/L N aC l和 82V1 (2. 5 倍体积）冰冻的 100%乙醇。颠倒离心管几次并以中度振荡。一 20°C孵育约30minD 13.4°(：，以最大速度离心15111丨11。弃去上清。加入约1111170%乙醇。离心5111丨11。小心地倒掉7 0 % 乙醇排干离心管中的液体。室温下在30m m H g 真空泵或Speedvac蒸发器中使DNA沉淀干燥>10m in。加入 I O X T E 缓冲液和2 4 6X 胶上样染料。室温下孵育几分钟。 M . 准备倒0 . 6 % 〜2.0% (m A O 溶解在 I X T B E 缓冲液（附录 3G ) 中的琼脂糖胶 (分离感兴趣的D N A 片段）。上样。把单拷贝和扩增的对照分别点在胶的第一和最后一泳道。用适当的电压和适当的时间电泳从而使感兴趣的条带能清楚地分开。

$1 5 .在 0. 5^g/m l的溴化乙徒溶液中染胶< l〇 m in ，染胶过程中中度摇动。用 u v 透射照明器对胶进行拍照。如果D N A 没被破坏，试剂齐全，可接着进行转移。如果D N ^ 有降解，进行差异P C R (备选方案2 ) 对 D N A 进行分析。 16•为了有效地转移> l〇 k b 的条带，把胶 depurinate到 0. 25m o l /L 的 H C l 中 15〜 30m i n 。对于所有感兴趣的条带，把胶泡在变性试剂中3〇 m i n ，并中度摇动。不要让胶的表层干燥。把胶泡在复性液中复性30m i n ，并中度摇动。 17.通过 Southern印记技术在6X S S C 中把D N A 转移到nitrocellulose膜上，转膜时间为 4h 至过夜（附录3G )。用钝头的镊子夹膜。为了对转移后的D N A 进行固定，根据操作手册把膜放在80°C 真空烘箱或U V cross-linker中烤2h。带电荷或不带电荷的尼龙膜只要在试验程序上进行适当的改变就可以使用。 18•准备好含lmg/m l 鲱精子D N A 的平衡的Quik-H y b 溶液。在固定后的膜与杂交液一起装进热封聚乙烯袋子，并加入约M O iUl Quik-H y b 溶液/cm2膜。用热封接器封住袋子。 65°C ，有摇床的水浴箱中预杂交> l5m m 。 19•对双链 [Ot-32P] dCTP-标记的探针煮沸约lOmin ( 约 i x i 0 6d p m 探针/ m l QuikH y b )。打开封闭的袋子，加入煮沸的探针。重新封闭袋子让探针在溶液中充分混匀。 65°C ，有摇床的水浴箱中预杂交1〜2h 。 20.准备三种洗脱液：用 2%3〇 3稀释的 2\、 0.5父和0.2\83(：，并加热到55。 (3。从袋子中取出膜，并依次用以上三种洗脱液洗， 55°C 每次 2〜5min。膜上没有D N A 的地方不能检测到计数，有的话也很少。对于有150个拷贝的扩增基因的对照，用 Geigercounter (如mini-monitor， P R I ) 至少记录1〇〇计数/s。单拷贝的对照可记录 20计数/s。 21•把膜暴露给放射自显影X -A R 膜一段时间，时间的长短根据对照信号的强弱决定 (通常是过夜或12〜14h)。用密度计对膜进行分析。备选方案1 缝隙杂交技术检测基因扩增这项技术的优点是只要1〜2jug没降解的D N A ，而且曝光时间只要几小时。然而这方法在检测低水平的扩增时没有southern杂交的敏感，对扩增的真实水平可能会被低估。附加材料（基本方案） 3.0m ol/LN aO H ，抽滤灭菌 2.0m ol/L 乙酸铵， pH 7.0, 抽滤灭菌斑点或缝隙杂父 manifold (如 Bio-Dot S F 、 Bio-Rad or Minifold2，Schleicher & Schuell) nitrocellulose 或尼龙膜 Whatman 3 MM 滤纸加热灯 1.用描述的方法（基本方案，第 1〜9 步）准备肿瘤组织的D N A 。 2. 用单拷贝D N A 对照作为稀释液2 倍稀释扩增的D N A 对照。不要用T E 缓冲液稀释$

扩増的D N A 。调解 D N A 浓度，从而在缝隙杂交使用的标准品，样品 D N A 的体积是一样的。 3. 让肿瘤 D N A 样品、对照和标准样品在转鼓仪上混合l O m i n。在 1.5m l 离心管中加 2Mg D N A 到 T E 缓冲液中至终体积为20〇 4 。设计不含D N A 的空白对照（只含 T E 缓冲液)。 4 . 每个离心管加人400julTE缓冲液和60pJ3.0m ol/LNaOH。振动离心管并短时离心。 65°C孵育 lh 。离心，冷却到室温（ 15min)。每管加入66〇 !Ltl2.0mol/L的乙酸铵。振动离心管并短时离心。 5•按照操作手册的说明组装斑点或缝隙杂交manifold。每个缝隙杂交上66(^1样品 DNA。对单拷贝和低水平检测，用欲湿的nitrocellulose膜能获得清晰的信号。对多探针，用尼龙膜。 6. 真空处理约1m m 。拆散装备并用钝头的镊子把膜从上层板上揭下。含 D N A —面向上，把膜放在一张干净的Whatman 3M M 滤纸上。用加热灯干燥5min。 7.把膜放在80°C 真空烘箱中烤2h 。按照描述（基本方案，第 18〜2 1 步）进行以下步骤：预杂交、杂交、洗，把膜暴露给放射自显影X -A R 膜（约 3h)，分析膜。备选方案2 差异 P C R 检测基因扩增对于这个操作程序，必须取来自同一染色体的远距离的DNA 片段（如其他的染色体臂）。由于染色体数目之间的差异，取来自另外的染色体上的基因作对照会产生假阳性和假阴性结果。对于检测低水平的基因扩增，这种方法不如Southern印记杂交敏感。注意：做 PCR需要特别的预防措施以防止污染。熟悉标准方法非常重要。附加材料（基本方案；标V 的条目参见附录1) V lO X Tag DNA 聚合酶缓冲液： 500mmol/LKa/100mmol/L Tris .CU pH8. 3 ( —20。。，保存时间< 1 8 个月；参见各自配方） V 25mmol/L MgCl2 V I. 25mmol/L 4dNTP 混合物 20Mm〇 l / L 目的和对照寡聚核苷酸引物，包括+ 链和一链序列 5U/jul DNA 聚合酶矿物油（如果热循环仪有加热盖子的话不需要）低分子质量 DNA marker (如 BioMarker Low; Bioventures) 0. 5m l微离心管热循环仪按照前面的描叙（基本方案，第 1〜9 步）准备肿瘤组织的DNA。 2 . 按照下面列出的顺序依次加人以下成分到0. 5ml微离心管中配制PCR反应物： 10/J 10 X T 叫 D N A 聚合酶缓冲液； 6jul 25mmol/L MgCl2; 16^ I. 25mmol/L 4dNTP 混合物，新鲜稀释（ 20(^1);

5jul20|umol/L目的寡聚核苷酸引物， + 链序列（ 1.0jLtmol/L); 5jul20jumol/L目的寡聚核苷酸引物，一链序列（ I. Ojumol/L); ljuUOjumd/L对照寡聚核苷酸引物， + 链序列（〇 .2^mol/L); lyZO^mol/L对照寡聚核苷酸引物，一链序列（ 0.2jum〇 l/L); 0. 5|ul 5U//uJ T叫 DNA 聚合酶（2. 5U)。把离心管放在冰上。使用的引物和模板的不同，引物和M g 2+ 的最佳浓度不同。 3 . 准备水空白（没 D N A ) : 加 44. 5W 反应混和物到装有5 5 . 5 4 无菌水的0.5m l 微离心管。轻轻混勻。覆盖 IOOjUl矿物油。把离心管放在冰上。 4 . 煮沸 10〜IOOj^g 肿瘤 D N A 3m i n 加人到含无菌水的0. 5m l 微离心管至终体积为 55. 5jul。加人45. 5jul反应混合物。 5•确定最佳的变性、退火、延伸的时间和温度。在这些条件下在热循环仪上进行P C R 反应。把 P C R 产物保存在4°C 直至被用于分析。通常的起始条件是： 93°C 变性I.5m i n 、 60°C 退火 l m i n 、 72°C 延伸 l m i n 。 6 . 对于< lkb的产物，准备2 % (m /V ) 的琼脂糖胶，用 I X T B E 缓冲液溶解（对于较大的产物用较低浓度的胶；附录 3G )。取 3^x1 扩增产物和对照于上样缓冲液混合后加到胶孔中，包括空白对照和低分子质量D N A 分子质量标准。 80V 电泳约Ih (直到溴酚蓝到达胶的末端）。用〇.5jug/m l 的溴化乙锭染胶，然后用蒸馏水冲洗，用 U V transilluminator拍照。内对照条带的密度按一定的比例向对于目的基因的扩增水平会按一定的比例减少。支持方案肿瘤组织的获取及处理材料肿瘤组织液氮或干冰 Cryotubes 1.如果可能，直接从手术室获取肿瘤组织。处理前除去staples和 suture。如果样本已经包被在mounting medium用于做冷冻切片（如 O T C )，处理前应尽可能多地除去 ^mounting medium。对于固态的肿瘤组织 2a. 选择肿瘤上有代表性的样本（分红或红色区域），避免肿瘤的被膜（硬的，白色区域）， fibrosis或坏死（褐色或黑色区域）。对于转移的肿瘤组织，只要是实质部分形成的肿瘤就可以被使用。把样本切成约5cm3 的小片有助于后面的保存和处理。如果可能，也要获取和保存作分子水平分析区域周围的组织切片用于做对照比较。 3a•尽可能快地冷冻组织碎片，最后是把组织碎片直接加到液氮中。转移冷冻管并储存在一80°C 。如果没有液氮，快速把样本装进干冰上的塑料管或容器中。一 8(rc或低于一80°C 保存直至使用。 4a. 如果肿瘤样本要在别的研究所使用，把样本装进做好标记并封好的塑料管或容器

中，放在干冰中连夜运送。对于液体肿瘤样本 2 b .确保样本含有一定量的肿瘤组织（ > 1 0 % ) 对于检测50〜 100倍的扩增是必需的）。像上面描述的快速冷冻小体积的样本（ < 3 m l)。如果样本> 3m l，进一步处理浓缩细胞成分。 3b.连夜运送干冰上的小体积的样本，如前所述。室温下连夜运送大体积液体样本。后者在用于提取D N A 之前可在一20°C保存< 2 d 。

来源：丁香实验

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