蛋白质间相互作用研究方法1

确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，“撒大网”

l        双杂交和其他双成分系统

第一阶段：诱饵 -LexA 融合蛋白的鉴定

诱饵 -LexA 融合蛋白的构建

1． 将编码诱饵蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的 LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为 pBait 。

2． 采用下列 LexA 融合基因和 lexAop-lacZ 报道质粒的组合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌：

a.       pBait + pMW12 （活化测定）

b.       pSH17-4 + pMW12 （活化的阳性对照）

c.       pRFHM1 + pMW12 （活化的阴性对照）

d.       pBait + pJK101 （抑制 /DNA 结合测定）

e.       pRFHM1 + pJK101 （抑制的阳性对照）

f.        pJK101 单独（抑制的阴性对照）

3． 将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上： CM(Glu)-Ura-His （针对质粒组合 a~e ）或 CM(Glu)-Ura （针对质粒组合 f ）。将培养板在 37 ℃培养 2~3 天以选择含有质粒的转化酵母克隆。

4． 制备转化子的母板。

活化和抑制活性的鉴定： X-gal 和 Leu2 表型的分析

5． 从 a~f 的每个转化中，用无菌的平头牙签挑选约 8 个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 平板上划 1 cm 长的线， 30 ℃孵育过夜。

6． 第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上：

转化 a~f ：划线到 CM(Glu, X-gal)-Ura 和 CM(Gal, X-gal)-Ura 上

转化 a~c ：划线到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上

7． 30 ℃将平板孵育到 4 天。

8． 对抑制和激活性进行分析：

a.       对于抑制活性，在划线接菌 12 ～ 24 h 时观察 X-gal 表型。

b.      对于激活性，在划线接菌 18 ～ 72 h 时观察 X-gal 表型。

c.       在 48 ～ 96 h 之间观察 Leu 表型。

9． 基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。

检测诱饵蛋白质表达

10．  在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用。

11．  对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子。

12．  转移 1.5 ml 培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞 3 ～ 5 min 。可见沉淀的体积 2 ～ 5 μ l 。小心倾去或吸除上清。

13．  加入 50 μ l 的 2 × SDS 凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰 / 乙醇浴中。

14．  将样品从干冰或 -70 ℃直接转到 100 ℃，并煮沸 5 min 。

15．  将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心 5 ～ 30 秒。加 20 ～ 50 μ l 样品到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。

16．  电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。

17．  为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含 LexA 融合的诱饵的酵母裂解液。

第二阶段：筛选一个相互作用子

转化文库

1．  挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子的酵母菌落，接种于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中， 30 ℃摇动过夜培养。

2．  稀释 20 ml 的过夜培养物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中至 OD₆₀₀ 约为 0.10 ～ 0.15 。在旋转摇床上 30 ℃摇动培养，直到 OD₆₀₀ 达到 0.50 左右。

3．  把培养物转移至 1 个 250 ml 的无菌离心瓶中，室温下 1000 ～ 1500g （使用 Sorvall GSA 转子 2500 ～ 3000 r/min ）离心 5 min 。移去上清，加入 30 ml 无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至 1 个 50 ml 的无菌 Falcon 管中。

4．  1000 ～ 1500 g （同上）离心酵母细胞 5 min 。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于 1.5 ml 含 0.1 mol/L 乙酸锂的 TE(pH 7.5) 中。

5．  在 30 个 1.5 ml 的无菌小离心管中分别加入 1 μ g 的文库 DNA 和 50 μ g 刚刚变形的载体 DNA 。马上在每个小离心管中加入 50 μ l 的酵母悬浮液。

6．  在每管细胞悬浮液中加入 300 μ l 含 40% PEG4000 和 0.1 mol/L 乙酸锂的无菌 TE(pH 7.5) ，混合（不要振荡）， 30 ℃培养 30 ～ 60 min 。

7．  每个试管中加入 40 μ l DMSO ，翻转混匀悬浮液，在 42 ℃的加热块上加热 10 min 。

8．  转化混合物铺平板：

其中的 28 管用于产生转化子：把每管混合物加到 24cm × 24cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 选择平板上，将细胞涂匀，将板 30 ℃孵育至菌落出现。

剩余 2 管：每管取 350 μ l 混合物加到 24cm × 24cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 选择平板上， 30 ℃培养平板至出现菌落；吸取每管剩余的 40 μ l 混合物用无菌的 TE(pH7.5) 或水做一系列的 1 ： 10 稀释，每份稀释液取 100 μ l 取在 100 mm CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上， 30 ℃培养平板至出现菌落。

初级转化子的收获和富集

9．  通过摇动法或刮擦法收获文库。

10．  如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌 TE （ pH7.5 ）或无菌水至 40 ～ 45 ml ，振荡或翻转试管悬浮细胞。

11．  使用台式离心机 1 000~1 500g 室温下离心试管 5 min ，弃去上清。

12．  重复步骤 10 和 11 。

13．  重新悬浮压紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。

14．  分别转移 1 ml 的细胞混合物于一系列无菌小离心管中， -70 ℃冻存。

相互作用蛋白的筛选

15．  解冻一份转化文库酵母细胞（来自步骤 14 ），用 CM(Gal-Raff)-Ura-Trp 培养基按 1 ： 10 稀释， 30 ℃摇动培养酵母细胞 4 h 来诱导文库中 GAL1 启动子的转录。

16．  在适当数量的 100 mmCM(Gal-Raff)-Ura-Trp-Leu dropout 平板上分别培养 10⁶ 个细胞。

17．  30 ℃培养平板 5 天。

18．  观察平板的生长，出现克隆时对其加以标记。

19．  第 5 天，形成一个按每天出现的不同克隆分组的主板。

20．  30 ℃ 孵育平板直到斑点 / 菌落形成。

阳性相互作用的初次确定：β - 半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测

21．  测定转录活性。

22．  解释结果。