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        组织和细胞RNA的制备

        互联网

        1501

         

        一、 组织和细胞总RNA提取:
        异硫氰酸胍法
        (一)试剂准备

         

         

        1.CSB缓冲液:42mM柠檬酸钠;0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基,N甲基甘氨酸钠);0.2 mM β-巯基乙醇。

         

         

        2. 变性液:异硫氰酸胍(终浓度 4 M)25g、CSB缓冲液 33ml,混合直至完全溶解,可在65℃助溶。4℃保存备用。

         

         

        3.2 M乙酸钠:pH 4.0。

         

         

        4. 异丙醇

         

         

        5. 无水乙醇、70%乙醇

         

         

        6. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)
        7.DEPC H2 O:100ml ddH2 O中,加入DEPC 0.1ml,弃分振荡,37℃孵育过夜。15磅高压灭茵,4℃保存备用。
        (二)操作步骤

         


        1. 样品处理:
        (1)培养细胞:收集细胞1-2×107 ,离心,500g×5min。对于贴壁培养细胞,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后,PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中;悬浮培养细胞可直接转移离心管;离心:500g×5min;PBS洗涤2次。弃上清,置冰浴。加预冷变性液2 ml,充分摇动,使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。
        (2)组织:取1-2g组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置组织匀浆器中,加入预冷的变性液12ml,在冰浴中充分匀浆。

        2. 2 M乙酸钠(pH 4.0)0.2ml,混合后将溶液转移至5ml离心管中。
        3. 加酚:氯仿:异戊醇2.2ml,颠倒混合用力振荡10s,冰上放置10min。
        4.4℃离心,12000g×20min。
        5.
        小心吸取上层含有RNA的水相,并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。
        6. 加等体积的异丙醇,置-20℃至少30min,沉淀RNA。
        7.4℃离心,12000g×15min。
        8.
        弃上清,再加变性液2ml重悬RNA沉淀物,振荡直至RNA完全溶解(必要时可65℃水浴促溶)。
        9. 加入等体积异丙醇,置-20℃ 30min。
        10. 4℃离心,12000g×15min。
        11. 弃上清,加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心,8000g×5min。
        12. 弃上清,将沉淀晾干。
        13. 加入适量DEPC H2 O溶液解RNA(65℃促溶10-15min)。

        (三)注意事项:
        1.所有实验过程均须避免Rnase的污染。
        2.要避免沉淀完全干燥,否则RNA难以溶解。
        TRIzol
        TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品,其操作方便、快捷。
        (一)试剂准备
        1. TRIzol试剂。
        2. 氯仿
        3. 异丙醇
        4. 75%乙醇(DEPC H2 O配制)
        5. DEPC H2 O

        (二)操作步骤
        1. 样品处理:
        (1) 培养细胞:收获细胞1-5×107 ,移入1.5ml离心管中,加入1ml Trizol,混匀,室温静置5min。
        (2) 组织:取50-100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。

        2. 加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。
        3. 4℃离心,12000g×15min,取上清。
        4. 加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。
        5. 4℃离心,12000g×10min,弃上清。
        6. 加入1ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g×5min,弃上清。
        7.  晾干,加入适量的DEPC H2 O溶解(65℃促溶10-15min)。
        (三)注意事项
        1.   样品量和Trizol的加入量一定要按步骤(1)的比例,不能随意增加样品量或减少Trizol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解。
        2.   实验过程必须严格防止RNsae的污染。
        二、 RNA定量
            RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径,用 ddH2 O稀释DNA样品n倍并以ddH2 O为空白对照,根据此时读出的OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度:
        RNA(mg/ml)=40×OD260 读数×稀释倍数(n)/1000
            RNA纯品的OD260 /OD280 的比值为2.0,故根据OD260 /OD280 的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低,说明有残余蛋白质存在;比值太高,则提示RNA有降解。

         

         

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