• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        PCR反应所需细菌DNA 模板的制备

        互联网

        1810
        相关专题
         

        从分析的标本中纯化核酸,即制备PCR 反应的模板,是使PCR获得成功的重要的第一步。由于PCR的用途各异,用于抽提核酸的起始材料种类可能差异很大(包括新鲜的、储存的和古代的)。每种特殊样品类型有各自的限制和抽提核酸的不同要求,但它们都有一个共同的标准,扩增的灵敏性要求特别注意不同材料、PCR产物、质粒或对照之间可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高度纯化的核酸,为最大限度材料污染的机会,可以使用快速而且简便的提取方法。

        【试剂与配制】

        TE缓冲液(pH8.0)

        裂解缓冲液:2%SDS,10μg/ml蛋白酶K溶于TE中。

        RNase A (10mg/ml)

        平衡酚

        氯仿:异戊醇(24:1)

        无水乙醇

        70% 乙醇

        3mol/L 乙酸钠(pH5.2)

        【操作方法】

        1、方法一

        (1)从平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量离心管中,加入400μl裂解缓冲液,混匀;

        (2)55℃~60℃,水浴15~20min;

        (3)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),混匀;

        (4)5000g离心10min;

        (5)吸取上层水相,再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1);

        (6)重复(3)~(4);

        (7)吸取上层水相,加1/10体积3mol乙酸钠及RNase A(终浓度为0.25~0.3μg/μl),轻摇,37℃保温30 min;

        (8)加入2.5倍体积的预冷无水乙醇,-20℃ 2hr;

        (9)10,000g 离心15min,弃上清,或用无菌细玻棒搅缠出DNA;

        (10)70% 乙醇洗2次,待乙醇蒸干后重新溶于小体积去离子水或TE缓冲液中(约20μl)。一次取5~10μl进行PCR 反应。

        2、方法二

        (1) 取一定数量的细菌 加入500μlTE缓冲液中;

        (2) 100℃煮沸10min,置冰浴保存;

        (3) 10,000rpm,4℃离心10min;

        (4) 取适量上清作为PCR 模板。

        3、方法三

        (1) 制备一定浓度的细菌/去离子水 悬液,反复冻融3次;

        (2) 10,000rpm,4℃离心10min;

        (3) 取适量上清作为PCR 模板。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序