RNA变性凝胶电泳技术方法

相关专题

 

RNA电泳包括非变性和变性凝胶电泳 两种，非变性电泳可以分离不同分子量大小的RNA，由于RNA分子具有二级和三级结构，这些结构会影响电泳结果，所以分变性电泳无法确定其分子量，而只有在变性的条件性，RNA分子才能完全伸展开。

一、实验目的

学习RNA琼脂 糖凝胶电泳的使用技术。

二、实验原理

RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳 进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。

判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱 应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。

三、材料、试剂及器具

1、 材料

总RNA提取 物。

2、 试剂

(1)0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。

(2)10x电泳缓冲液。

吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0)

NaAc 0.1mol/L

乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L

(3)50mL变性琼脂糖凝胶(1%)

(4)10x电泳缓冲液 5 mL

琼脂糖 0.5 g

0.1%DEPC水 36.5 mL

加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。

(5)上样缓冲液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。

(6)甲酰胺(去离子)。

3、器具

(1)电泳系统

(2)紫外透视仪

四、操作步骤

1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。

2、 制胶：

称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

3、 加样：

在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。

4、 电泳：

打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。

5、 电泳结束后通过紫外透视仪观察。

五、注意事项

RNA实验过程中RNA污染是最常见的。RNA很容易被RNA酶分解，在实验过程中需要防止RNase的污染，因此实验过程中涉及的所有实验仪器均要经过杀菌、消毒，各种试验试剂也需要用DEPC水来配置。