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        从猪脾中提取DNA

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        1. 操作步骤:
        取鲜猪脾,去脂、血,称取10g,用预冷的1×SSC溶液洗2次,剪碎。
        按睥:1×SSC=1; 5W/V 加入50ml预冷的1×SSC,用高速组织
        捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒。
        将匀浆液放在烧杯中, 于冰盐浴中冷却30分钟。4000转/分钟离心10分钟。充掉上清。沉淀物中再加2倍体积的1×SSC搅匀,离心,弃上清,重复2次。
        将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA 溶液中。边搅拌边漫漫滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L,继续搅60分钟,以确保氯化钠全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中,加入同体积氯仿—异戊醇,激烈振荡20分钟,4000r离心20分钟,上层水相取出后倒入烧杯,以同积氯仿—异戊醇重复去蛋白2次。
        取出水相于烧杯中,逐渐加入2倍体积95%乙醇,玻棒搅动,DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干,用70%乙醇洗DNA纤维2次,用95%乙醇洗一次,再用乙醚洗一次,取出并挤干。

        2. 实验材料,仪器和试剂:
        (1) 实验材料:新鲜猪脾:
        (2)仪器:量筒:1×10、3×100烧杯:2×100,2×250;磨口锥形瓶:1×250、1×500;吸管:1×1、1×10;滴管、玻棒、离心机 、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。
        (3) 试剂:
        ① 20×SSC:175.2gNaCL,88.2g柠檬酸钠•2H2O,PH=7.0加水至1000ml;
        ② 1×SSC,0.1×SSC由①做相应的稀释得来;
        ③ NaCL-Na2EDTA 液:8.77gNaCL,3.72gNa2EDTA溶于800ml蒸馏水中,用固体NaOH调PH=8后定容至1000;
        ④ 5%SDS(W/V):6gSDS溶于100ml45%乙醇中;
        ⑤ 氯仿-异戊醇=24:1(体积比)
        ⑥ 其他:95%乙醇,盐冰.数据:DNA重,产率:

        二苯胺显色法测定DNA含量
        强酸、加热条件下,可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂,而产生嘌呤碱基,脱氧核糖与嘧啶核苷酸 。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛,此物与二苯胺反应生成蓝色化合物,在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度,而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定,而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香,羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质,干扰测定。

        1.二苯胺试剂:使用前称取0.8g二苯胺(需在70%乙醇试剂中重结晶2次),溶于180ml冰乙酸中,再加入8ml过氯酸(60%以上),混匀待用,临用前加入0.8ml 1.6%乙醛溶液,所配试剂应为无色。
           每组需56ml
        共需2800ml
        2.DNA标准溶液:(须经定磷法确定其浓度)取标准DNA以0.01N NaOH配成200微克/毫升的标准液。
        每组需12ml
        共需600ml
        3.1.6%乙醛:取47%乙醛3.4ml,加重蒸水定容至100ml(放于冰箱中,一周之内可以使用)。
           共需70ml
        4.(测样品液:准确称取猪脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克/毫升的溶液。
           每组需4ml
           共需200ml

        操作方法:
        1. DNA标准曲线的制定:
        取10支试管,分成2组,依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水,使之都成为2ml。另取2只试管,各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂,混匀。于60 恒温水浴中保温1h,冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值,以DNA浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。
        2. 制品的测定:
        取2支试管,各加2ml待测液(内含DNA应在标准曲线的可范围之内)和4ml二苯胺试剂,摇匀。其于操作同标准曲线的制作。
        3. 根据测得的光吸收值,从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量,计算出制品中的百分含量。

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