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        从琼脂糖中凝胶中回收DNA片段的技术

        互联网

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        相关专题
        DNA连接与转化

        琼脂 糖中回收DNA片段

        实验目的:

        掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的技术。

        DNA片段的胶回收:

        电泳洗脱法

        低熔点琼脂糖凝胶电泳 挖块法

        冻融回收法

        玻璃奶回收法

        柱回收法(按说明书进行)

        胶回收注意事项:

        电泳槽 用ddH2O反复清洗干净,倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液;

        根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板;

        切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶;

        要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤;

        熔胶要完全。

        目的基因片段与载体 连接

        实验目的:掌握DNA片段的体外连接技术。

        DNA连接 酶:

        能催化双链DNA片段紧靠在一起的5’-P末端和3’-OH末端之间形成磷酸二酯键,使两末端连接。

        E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶

        1、E.coli DNA连接酶:

        由E.coli基因lig编码,需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)作为辅助因子。

        修复双链DNA上的单链缺刻(nick),用于连接匹配粘端。

        2、T4 DNA连接酶:

        从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到,由T4基因DNA30编码,需ATP作为辅助因子。

        修复双链DNA上的单链缺刻(nick),用于连接匹配粘端;

        连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺刻;

        连接平端双链DNA分子

        1、修复双链DNA上的单链缺刻,用于连接匹配粘端。

        带匹配粘端的DNA分子靠近时,自发形成暂时的碱基配对,利于连接酶把紧邻的5’-P与3’-OH连接到一起。

        不同DNA片断通过匹配粘端的连接。

        同一DNA片断通过匹配粘端的连接--自身环化。

        2、连接RNA-DNA杂交双链中DNA链上的缺刻。

        3、连接带平端的双链DNA分子。

        注意:

        DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接;

        只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick);

        不能连接双链中1个或多个核苷酸缺失所致的缺口(gap)。

        E.coli DNA连接酶:连接匹配粘端;

        T4 DNA连接酶:连接匹配粘端、平端。

        最常用的为T4 DNA连接酶。

        匹配粘端的连接:

        1)哪些情况下会产生匹配粘端?

        同一限制酶切割产生;

        同尾酶切割产生。

        2)可以用E.coli DNA连接酶、也可以用T4 DNA连接酶。

        3)连接效率高。

        4)连接后的情况如何?

        同一限制酶切割的DNA片段,连接后仍保留该限制酶的识别序列。

        两种同尾酶切割的DNA片段,连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

        平端的连接:

        1)哪些情况下会产生平端?

        限制酶切割产生;

        RNA逆转录 合成的cDNA为平端双链;

        PCR 扩增也能产生,如用Pfu扩增时。

        2)只能用T4 DNA连接酶。

        3)连接效率低,仅为粘端的1%。

        4)连接后的情况如何?

        同一限制酶切割的DNA片段,连接后仍保留该限制酶的识别序列,有时还出现另一种新的限制酶识别序列。

        不同限制酶切割的DNA片段,连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

        提高平端连接效率的方法

        加大连接酶用量(10倍于粘端连接,1-2U);

        加大平端DNA片段的浓度;

        加入10% PEG 8000;

        加入单价阳离子(NaCl),终浓度150-200 mM。

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