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        外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞的方法

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        DNA连接与转化 质粒

        一、 实验目的

        学习外源DNA导入原核生物细胞的方法

        二、 实验内容

        热激处理将外源质粒 DNA导入原核细胞。

        三、 实验原理

        利用CaCl2处理感受态体细胞,然后通过热休克处理,即置于42℃高温热激90秒,热休克后,需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上,使其表达足够的蛋白,以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。

        <center> </center>

        四、 实验方法与步骤

        1、 制备含有Amp抗生素的LB平板。

        2、 取一个1.5ml离心管,加入100&mu;l感受态细胞悬液,置冰上:加入20ul质粒T+G(提取的质粒DNA稀释500X),用移液器 轻柔混匀。冰上静置20min。

        3、 42℃水浴中热激90秒,然后迅速置冰上3~5min。整个过程不要振荡菌液。

        4、 加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时,使细菌 恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

        5、 取100ul菌液,至含有抗生素Amp的LB固体培养基上,涂布均匀。

        6、 待菌液被培养基吸收后,37℃倒置培养12~16小时,菌落生长良好而又未互相重叠时,取出。

        7、 计算转化率

        8、 统计每一个培养皿中的菌落数。

        9、 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:

        10、 转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积;

        11、 转化频率(转化子数/&mu;g质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(&mu;g)

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