• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        专家建议:从FFPE样品中提取DNA的小技巧(下)

        互联网

        2139
        相关专题
         

        问题三:你如何优化DNA提取 的效率?你认为怎样才算是好的产量? ( 更多阅读专家建议:从FFPE样品中提取DNA的小技巧(上))

        Sunil Badve 印第安那大学药学院

        延长蛋白水解酶的作用时间。大于100 ng/ul就算是好的产量吧。

        Mark Bouzyk 爱默里大学(EMORY UNIVERSITY)药学院

        提取过程的关键是蛋白酶消化要持续2-3天。我们发现如果只消化几小时的话,提取的效果就不大好。根据我们的经验,好的产量是从3个5um切片中得到1-3ug的DNA。当然,这在很大程度上是由切片本身的质量来决定的。

        Susan Long 俄亥俄州立大学医学院

        你必须确保这些组织在上QiaAmp柱之前,已经消化完全了。从10-20个小的组织切片(小于5mm2)一般能得到5-10ug的DNA,而3-5个大的组织切片(大于5mm2)的DNA产量一般在40ug或更多。

        Jeffrey Mason 美国国防病理中心

        提取效率与蛋白酶K消化步骤密不可分。延长消化时间能改善DNA的回收率以及片段的平均长度。蛋白酶K的消化步骤最多可延长到5天,每天加入新的消化液。如果组织还没有完全溶解的话,就要继续消化。最后结果应该是表面光滑的半透明溶液,看不到任何微粒。孵育时间也取决于组织。例如,低密度组织(肺)所需的孵育时间就比高密度组织(心脏)少。

        我认为好的产量应在200-500 mg/ml。DNA浓度可以通过吸光度或荧光分析来测量。

        问题四:你如何确定提取的DNA的质量?你可以接受的片段化程度?

        Sunil Badve 印第安那大学药学院

        A260/A280在1.7与1.9之间。我们没有考虑它的片段化程度。

        Mark Bouzyk 爱默里大学(EMORY UNIVERSITY)药学院

        我们通常使用PicoGreen来测定DNA的数量和质量。我们大部分的下游分析是Taqman或单碱基延伸基因分型,所以500bp左右的片段都是可以接受的。但有时可能需要更长的片段(比如illumina Infinium就需要2kb),我们推荐用Agilent的生物分析仪来测量片段化大小,与常规的凝胶电泳相比,它需要的样品量很少。

        Susan Long 俄亥俄州立大学医学院

        我是通过Nanodrop分光光度计来检测浓度和260/280比值的,然后进行PCR 。通常我只需要能扩增出200-400bp的片段就行了。

        Jeffrey Mason 美国国防病理中心

        我们利用两种方法来估计DNA的质量。第一种是在70度变性DNA,然后取200ng去跑1%的琼脂 糖胶,来确认大小分布。大小应该是分布在100bp到3000bp之间。如果用蛋白酶K消化6天以上,还可以看到更长的片段。第二种方法是通过实时定量PCR来估计DNA的质量。我们会用3-4套引物及1-2个探针来扩增看家基因GAPDH或b2微球蛋白。

        对于实时定量PCR 而言,100bp到3000bp的DNA片段就能得到一个理想的结果。如果是要做芯片研究的话,可能需要更长的片段。

        从上面他们的谈话中,你可以看到样品不同,下游的分析不同,从FFPE样品中提取DNA的步骤也会有所差异。希望你能从他们的经验中汲取精髓,摸索出最适合你的DNA提取方法。我们还挑选了一些相关文献,帮助你优化实验。

        Aviel-Ronen S, Qi Zhu C, Coe BP, Liu N, Watson SK, Lam WL, Tsao MS. (2006) Large fragment Bst DNA polymerase for whole genome amplification of DNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissues.BMC Genomics. 7:312.

        Coudry RA, Meireles SI, Stoyanova R, Cooper HS, Carpino A,Wang X, Engstrom PF, Clapper ML. (2007) Successful application of microarray technology to microdissected formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Mol Diagn. 9(1):70-79.

        Coura R, Prolla JC, Meurer L, Ashton-Prolla P. (2005) An alternative protocol for DNA extraction from formalin-fixed and paraffin wax-embedded tissue. J Clin Pathol. 58(8):894-5.

        Gilbert MTP, Haselkorn T, Bunce M, Sanchez JJ, Lucas SB, Jewell LD, Van Marck E,Worobey M. (2007) The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-Which methods are useful when? PloS ONE 2(6):e537.

        Gillio-Tos A, De Marco L, Fiano V, Garcia-Bragado F, Dikshit R, Boffetta P, Merletti F. (2007) Efficient DNA extraction from 25-year-old paraffin-embedded tissues: study of 365 samples. Pathology. 39(3):345-8.

        Little SE, Vuononvirta R, Reis-Filho JS, Natrajan R, Iravani M, Fenwick K, Mackay A, Ashworth A, Pritchard-Jones K, Jones C. (2006) Array CGH using whole genome amplification of fresh-frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tumor DNA. Genomics. 87:298-306.

        McSherry EA, McGoldrick A, Kay EW, Hopkins AM, Gallagher WM, Dervan PA. (2007) Formalin-fixed paraffin-embedded clinical tissues show spurious copy number changes in array-CGH profiles. Clin Genet. 72: 441-447.

        Shi SR, Datar R, Liu C,Wu L, Zhang Z, Cote RJ, Taylor CR. (2004) DNA extraction from archival formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: heat-induced retrieval in alkaline solution. Histochem Cell Biol. 122(3):211-8.

        Talaulikar D, Gray JX, Shadbolt B, McNiven M, Dahlstrom JE. (2008) A comparative study of the quality of DNA obtained from fresh frozen and formalin-fixed decalcified paraffin- embedded bone marrow trephine biopsy specimens using two different methods. J Clin Pathol. 61(1):119-23.

        Thompson ER, Herbert SC, Forrest SM, Campbell IG. (2005) Whole genome SNP arrays using DNA derived from formalinfixed, paraffin-embedded ovarian tumor tissue. Hum Mutat. 26(4):384-9.

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序