耐热DNA聚合酶常见问题(Thermpholic Polymerases FAQ)

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NEB公司研发的VentR和Deep VentR DNA聚合酶都是克隆于海底高温喷泉的微生物，其耐热性能和保真性能远高于Taq DNA聚合酶。VentR的半衰期在100°C时是1.8小时，是Taq DNA聚合酶的18倍，而Deep VentR则对高温的耐受性更强，半衰期是8小时。两者的保真性能是Taq DNA聚合酶的5-15倍。由于具有3'→5'的外切酶活性，可去除错配的碱基，从而使延伸反应顺利地进行下去，因此，更适用于long PCR 反应。

在不断寻找新酶的基础上，NEB还致力于对原有酶的修饰和改造，VentR(exo-)和 Deep VentR(exo-) DNA聚合酶就是在原有酶的基础上，去除其3'→5'的外切酶活性，使其更适用于双脱氧法测序 和高效率的PCR。虽然保真性能比VentR和Deep VentR有所降低，但仍是Taq DNA聚合酶的2倍。

如何应用DNA聚合酶合成4-15 kb的PCR 产物?

使用正确的酶量。使用具有校读功能的VentR DNA聚合酶 时，有时用量少，效果会更好。使用不具有校读功能的VentR(exo-)或Deep VentR(exo-)DNA聚合酶时，每100 μl反应体系中，用2-4个单位的酶量。如果反应体系缩小，相应调整酶量。

采用正确的引物延伸时间，按每延伸1 kb需要1分钟来计算。当使用具有校读功能的DNA聚合酶 时，延伸反应时间不要超过计算时间的20%。使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶时，请分别尝试2、4和6 mM的MgSO4浓度。

为什么PCR反应后，没有产物或条带模糊?

检查Mg2+浓度、聚合酶用量及延伸反应时间。尝试不同退火温度及Mg2+的浓度。用酚/氯仿抽提及酒精沉淀法纯化DNA。避免高盐带入PCR反应体系中。确保dNTP没有被水解。某些助溶剂如：100 μg/ml BSA，1-10%甲酰胺(formamide)或1-10%DMSO有助于一些引物和模板的结合。

什么原因可以造成没有加入模板的阴性对照出现模糊条带?

一旦某些Km值较低的DNA聚合酶(特别是具有校读功能的聚合酶)不能有效地结合到引物的3'末端，可使引物形成一种特殊结构(primer artifact)。这种结构含有单链和双链的区域，形成引物单链或双链的多聚体，很难迁移出上样孔，或自上样孔形成模糊条带。如果出现这种情况，建议降低引物浓度，缩短反应时间，或使用VentR(exo-)、Deep VentR(exo-)和Taq DNA聚合酶。

使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶，产生什么样末端的DNA片段?

具有校读功能的DNA聚合酶(如VentR、Deep VentR和9oNm)产生95%的平末端。与Taq DNA聚合酶相似，不具有校读功能的DNA聚合酶，如VentR(exo-)和Deep VentR(exo-)产生两种末端，其中70%是平末端，30%是3'末端单个碱基突出的粘性末端。

我想克隆PCR产物，这个PCR产物是用VentR 或Deep VentR DNA聚合酶合成的，选用哪种克隆方法更好?

最好的方法是：用平末端克隆法将片段插入已去磷酸化的载体上，(或使用NEB平端克隆试剂盒 #E0103)。插入片段的5'末端应磷酸化，除非在引物合成时，引物的5'末端已有磷酸基。

PCR产物是否能在PCR反应体系中直接磷酸化?

不能，因为PCR反应中的硫酸胺会抑制T4多聚核苷酸激酶活性。可采用胶回收或G25离心柱法来纯化DNA。在50 μl反应体系，加入1×T4 Polynucleotide

Kinase Buffer、1 mM ATP 和 小于200 pmol的5'羟基末端的DNA，70°C温育5分钟，冰上冷却后，再加入20个单位的T4多聚核苷酸激酶，37°C温育30分钟。

怎样才能提高PCR产物平滑末端的连接效率?

载体应该去磷酸化以降低自身环化，插入片段的5'末端应具有磷酸基。其它提高连接效率的方法还有：降低ATP在连接反应缓冲液中的浓度，增加插入片段与载体的比例或使用快速连接试剂盒(NEB #M2200)。另外，可使用平端克隆试剂盒(NEB #E0103)。

VentR或Deep VentR DNA聚合酶产生平滑末端，可是我要用的克隆试剂盒是针对3'末端单个腺嘌呤碱基突出的粘性末端而设计的，怎么办?

用Taq DNA聚合酶处理PCR产物的平末端。首先用酚、氯仿抽提及2倍异丙醇沉淀，纯化DNA，然后将纯化后的DNA溶于1× Thermopol Reaction Buffer(随Taq DNA聚合酶提供)，再加入1个单位的Taq DNA聚合酶和200 μM dATP，混匀，72°C温育20分钟。

能否用VentR或Deep VentR DNA聚合酶来处理Taq DNA聚合酶产物，得到平滑末端的PCR产物?

能。首先将Taq DNA聚合酶的PCR产物用酚、氯仿抽提及2倍异丙醇沉淀，得到进一步纯化的DNA，然后将纯化后的DNA溶于1× Thermopol Reaction Buffer(随VentR或Deep VentR DNA聚合酶提供)，在100μl反应体系中，加入1-2个单位的VentR或Deep VentR DNA聚合酶和200μM dNTP，混匀，72°C温育20分钟，产品即可产生平滑末端。