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        T4 DNA聚合酶

        相关实验:T4 DNA 聚合酶实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        一、50 μl 反应体积:

        (1)50 mmol/l  Tris·Cl,pH8.0

        (2)5 mmol/l  MgCl2

        (3)5mmol/l  DTT

        (4)100 μmol/l  4dNTP混合液

        (5)50 μg/ml  BSA

        (6)0.1 U  T4DNA聚合酶

        (7)2 μg  DNA

        (8)11℃温育20 min,加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加热10 min以终止反应。

        (9)反应体枳、4种dNTp的浓度、反应温度可依具体应用而变。
         
        二、dNTp浓度的效应
         
        1.  高浓度的dNTP在通常实验下可以增加聚合酶活性对外切酶活性的比值。

        2.  在标记实验中,标记了dNTP的浓度降至1到2 μmol/l,但标记dNTP不能低于1 μmol/l 浓度,否则当dNTP耗竭时,会导致其外切酶活性对的降解。
         
        三、度的效应
         
        用T4 DNA聚合酶标记3’末端时,反应温度保持在11℃,在较髙温度下,其外切酶活性易降解DNA模板。

        常见问题

        一、缓冲系统的相容性
         
        许多限制性内切酶能在T4 DNA聚合酶的缓冲系统进行切割反应,同时,T4 DNA 聚合酶也能直接使用。

        二、应用
         
        1.  放射性标记DNA片段的3’末端,含5’凸出端的DNA片段及浓度为1~2 μmol/l 的适当[α-32P]dNTP,在11℃温育20 min。
         
        2.  选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端,即所谓的“置换合成”。双链 DNA片段在dNTP存在下与T4 聚合酶温育,其3’末瑞的外切酶活性导致从 3’末端降解DNA,当补加4种dNTP后,可激活其聚合酶活性,延伸DNA镆板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液,可获得最隹标记效果。

        3.  变双链DNA的粘性末端成平端,便于平端克隆。在髙浓度4dNTP种存在下,酶促的 降解终止于双链区,类似地,如果末端存在5‘凸出,酶将延伸凹进陷的3’端直至与5’端平齐。在实际应用中,DNA与T4 DNA聚合酶和浓度各100 μmol/l dNTP在温育20 min。 

        来源:丁香实验

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