• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        耐热四膜虫的电穿孔转化

        相关实验:耐热四膜虫的电穿孔转化实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 培养适当的 2 种不同交配型的抗生素抗性细胞到对数期。

        2. 以约 2X105 细胞/ml,在 10 mmol/L pH 7.5 的 Tris 中洗涤细胞,常规交配使细胞饥饿 6~24 小时。

        3. 检测每种交配型细胞密度,调为 3X105 细胞/ml。在烧瓶中混合等量的相反交配型的细胞,体积适当,以确保固定时通气量合适。

        4. 添加抗生素复合物,用铝箔或棉絮塞子盖上烧瓶。

        5. 开始交配,让细胞在 30℃ 静置。

        6. 4~6 小时后,检测交配效率。如细胞配对超过 80%,接着进行转化步骤。

        7. 交配 10 小时后,将细胞转到 50 ml 的 Cormung 塑料圆锥形试管中,用 pH 7.5 的 10 mmol/L HEPES 轻轻洗涤细胞。

        8. 在 10 mmol/L HEPES 中重悬细胞到约 3X107 细胞/ml。

        9. 在 HEPES 缓冲液中混合 125 μl 细胞和 125 μl 准备好的质粒 DNA,立即进行电穿孔。

        10. 用 0.2 cm 的样品池,电压设为 250 V,电容 275 mF,电阻 13 欧姆。

        11. 在室温下样品池静置 1 分钟,然后用添加了抗生素混合物的在 20 ml SPP 中重悬细胞。

        12. 用 SPP 系列稀释细胞,将 25 ml 加到含有添加了抗生素混合物的 175 μl SPP 的 96 孔微量滴定板中。

        13. 12~18 小时后,在所选的每个转化孔中加入 50 μl 巴龙霉素,600 μg/ml 10 mmol/L HEPES,或另一种抗生素。

        14. 4~5 天后,用 Poisson 分布计算转化产量。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序