• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        拟南芥组织提取RNA及RT-PCR

        互联网

        5100

        试剂和器皿

        所有试剂都用DEPC水配置,所有器皿都在180℃ 烘8hr或者在双氧水中泡半小时以上,`所有的离心管和PIPET都用新的。

        DEPC 水。

        RNA Extraction Buffer: 0.2M    Tris-Cl Ph 8.0 ),0.4M LiCl25mM EDTA 1% SDS

        3M    NaAc pH5.2

        2M LiCl

        RNase free 的水饱和酚。

        氯仿。

        无水乙醇。

        70% 乙醇。

        DNase(RNase free)

        冰若干。

        研钵和研棒,180℃ 烘8hr。

        小棒磨,双氧水中泡半小时以上。

        实验步骤

        1. 小量(如RT-PCR):新鲜的绿叶或花等组织适量,置于 1.5 ml的离心管中, 盖紧管盖,立刻放入液氮中。取出后将1.5 ml离心管放入管内置满液氮的15ml离心管,保持低温环境。用小磨棒研磨成粉,加入400 m l RNA Extraction Buffer和400 m l酚,置于冰上。

        大量(如NORTHERN):收集大量的植物组织,用液氮速冻后在研钵中充分研碎,然后将植物组织粉末用新PIPET移入另一个预先加入适量的RNA Extraction Buffer和酚(体积比1:1)的研钵中,混匀后分装在1.5 ml的离心管中,每管800 m l。

        2.剧烈震荡5次。

        3.13200rpm 离心6 min,取上清(建议用酚抽两次),移入另一个装有300 m l氯仿的1.5 ml离心管中,剧烈震荡。

        4.13200rpm 离心6 min,取上清,移入另一个装有1000 m l无水乙醇和40 m l 3M    NaAc的1.5 ml离心管中,-20℃ 放置20min以上。

        5.13200rpm离心10 min,弃上清。

        6.70%乙醇洗一次, 13200rpm离心5min,弃上清,超净台吹干。

        7.加入10-30 m l DEPC水。-20℃ 短期保存,-70℃ 长期存放。

        (一般操作至此,如NORTHERN实验。高质量RNA的获取可以用以下步骤纯化,如RT-PCR实验。)

        8. 加入400 m l 2M LiCl, 尽量溶解。(LiCL可沉淀大分子量的RNA,如果要操作分子量较小的RNA样品,建议省去这一步)

        9.13200rpm离心10 min,弃上清,加入100 m l DEPC水,10 m l 3M NaAc,300 ul无水乙醇,混合均匀,-20℃ 放置20min以上。

        10.13200rpm离心10 min, 弃上清。

        11.70%乙醇洗一次, 13200rpm离心5 min,弃上清,超净台吹干。

        12. RNA 定量,取 RNA DNase 处理, 1ugRNA 1 单位的 DNase 处理,处理体系不宜过大( 10-20uL )。 37 度放置 30min

        13. 取部分处理的 RNA ,稀释至 RT 后准备用做模板扩增的浓度, PCR 验证是否有 DNA 污染

        14. 将体积扩至300 m l(加入DEPC水),加入300 m l酚,剧烈震荡。

        15. 13200rpm 离心6 min,取上清,移入另一个装有600 m l无水乙醇和30 m l 3M    NaAc的1.5 ml离心管中,-20℃ 放置20min以上。

        16.13200rpm离心10 min, 弃上清。

        17.70%乙醇洗一次, 13200rpm离心5 min,弃上清,超净台吹干

        18.溶于10-30 m l DEPC水。电泳定量,(OD定量)。-20℃ 短期保存,-70℃ 长期存放。

        (13-18步也可省略,直接进行RT反应)

        19. 取适量RNA进行RT反应(参见具体使用的试剂盒)

        20. RT反应后,如果未作13-18部,需用酚/氯仿抽提,以去除12步加入的DNase.如做了13-18步,也建议用酚/氯仿抽提一下

        21. PCR反应

        (责任编辑:大汉昆仑王)
        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序