竞争性 RT-PCR: 竞争子 RNA 的构建实验

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

乙醇

去除 RNA 酶的双蒸水

2. 核酸和寡核苷酸

DNA 模板（0.5~1.0ug 线性化的质粒模板或 0.1~0.5ugPCR 模板）

3. 放射性复合物

[a-32P]ATP(10mCi/ml)(lCi=37 GBq)

4. 实验器材

RT-PCR 竞争子构建试剂盒（Ambion; 包括 T7RNA 聚合酶、10 倍的转录缓冲液、5 倍的 NTP 溶液、MnCl2、DNA 酶 I、凝胶上样缓冲液、探针洗脱缓冲液）

二、方法

1. 室温下准备转录反应，按下列顺序添加试剂。

10 倍的转录缓冲液                                     2ul

5 倍的 NTP 溶液                                         4ul

DNA 模板                                                    1~5ul

[a-32P]ATP(10MCi/ml)                                 0.4ul

T7RNA 聚合酶                                             2ul

2. 轻弹管子混匀试剂，简单离心，收集反应混合物于管底。

3. 37°C 孵育转录反应 2~4 h。

4. 从每种样品中取出1ul, 用于以后的竞争子浓度测定。

5. 在转录反应混合物中加入 40ul 探针洗脱缓冲液和 200ul 乙醇。

6. -80°C 孵育 20 min。

7. 4°C 最大转速离心，沉淀转录反应产物。

8. 吸走上清液，用 70% 的乙醇清洗沉淀并在空气中干燥沉淀。

9. 用 16ul 去除 RNA 酶的双蒸水溶解沉淀。

10. 95°C 热变性重悬的沉淀（其中含有 DNA 模板和被转录的 RNA)2 min。

11. 加入 2ul10 倍的转录缓冲液和 2ul 去除 RNA 酶的 DNA 酶 I(5U/ul)。

12. 轻弹管子混合反应试剂，离心，收集反应混合物于管底。

13. 37°C 孵育 lh。

竞争子的纯化

14. 添加 22ul 凝胶上样缓冲液Ⅱ到 DNA 酶 I 的反应中。

15. 95°C 对样品进行变性 3 min。

16. 在变性聚丙烯酰胺（6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素）凝胶上跑样，直到溴酚蓝达到凝肢底部。

17. 从凝胶上去掉一个玻璃板，用塑料膜覆盖凝胶，放上 X 射线片放射自显彩 30 min~2 h。

18. 显影 X 射线片并对齐放在凝肢的下面，用解剖刀或剃刀刀片从凝胶上切下全长 RNA转录本。

19. 转移凝肢碎块到小离心管中。加 300ul 探针洗脱缓冲液，通过简单离心浸没碎块。

20.37°C 孵育过夜。

21. 扔掉管中的丙烯酰胺凝胶碎块，加入 600ul 乙醇包含 RNA 转录本的探针洗脱缓冲液。

22.-80°C 孵育 20 min。

23.4°C 最大转速离心 15~20 min。

24. 用 70% 乙醇洗涤沉淀，空气中干燥。

25. 用 15ul 去除 RNA 酶的双蒸水溶解沉淀。

竞争子 RNA 定量

26. 转移 1ul 转录反应物和 1ul 纯化的竞争子 RNA 到闪烁管中，加入闪烁液，闪烁记数。

27. 使用记数结果，用下面的公式计算出竞争子的浓度（umol/ul 或拷贝/ul)。

竞争子 RNA(umol/L)=(1ul 纯化的竞争子 RNA 的 cpm÷1ul 转录反应物的 cpm)X(竞争子 RNA 中的 500umol/LATP/A 的总量）
竞争子 RNA(拷贝/ul)=(1ul 纯化的竞争子 RNA 的 cpm÷lul 转录反应物的 cpm)X(1ul 竞争子 RNA 中 3X10¹⁴ATP 分子/A 的总量）

28. 竞争子应以不小于 6X10¹⁰ 拷贝/ul 或 0.1umol/L 的浓度储存在-20°C 条件下，保期可达 1 年。