哺乳动物基因组DNA制备

一、目的及要求

1． 掌握提取基因组DNA的原理和方法、步骤。

2． 了解相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。

二、实验原理

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和Souther分析。

三、仪器与耗材

仪器：台式离心机、玻璃匀浆器、高压灭菌锅、恒温水浴器、微量取样器和吸头、无菌过滤器、10mL注射器

耗材： Eppendorf管、吸头

四、试剂

1. 0.5M Tris-HCl（pH8.0）

2. 0.5M EDTA（pH 8.0）

3. 5MNaCl

4. 3M NaAc（pH 5.2）

以上均高压灭菌

5.鼠肝

6.组织匀浆液：100mMNaCl，10mM Tris-HCl（pH8.0），25 mM EDTA（pH8.0）

7.酶解液：200mMNaCl，20mM Tris-HCl（pH8.0），50 mM EDTA（pH8.0），200μg/mL蛋白酶K，1%SDS

8.TE缓冲液：1 mM EDTA （pH8.0），10 mM Tris-HCl （pH8.0）

9.蛋白酶K：10mg/mL配好后用一次性过滤器过滤，-20℃保存。

10.RNA酶：将胰RNA酶溶于10mM Tris-HCl（pH7.5），15mMNaCl溶液中，浓度10mg/mL，于100℃水浴处理15min以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存。

11.λDNA/EcoRI+HindIII marker

12.酚：氯仿：异戊醇=25：24：1（体积比）

13.氯仿：异戊醇=24：1（体积比）

14.5XTBE（5倍体积的TBE储存液）

Tris 54g

硼酸27.5g

总体积1000mL pH8.0

15.6X上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液

16.动物基因组DNA快速提取试剂盒

五、操作步骤（两人一组）

（一） 小鼠肝脏DNA制备

1.取200mg鼠肝，用冰块处理研磨直至无组织块存在。将粉末移入1.5ml离心管中加入1ml溶液B，震荡均匀，室温放置5分钟。

2.12000rpm离心5分钟。

3.将上清移入5ml离心管中，加入2.5ml溶液C,20ml溶液A，50ml溶液D,充分混匀，室温放置20分钟。

4.10000r/min离心5min，弃上清。

5.加入溶液C，充分混匀，10000r/min离心2min，弃上清。

6加入溶液E，充分混匀，10000r/min离心2min，弃上清

7.重复6步骤

8.12000r/min离心2min，吸干上清，室温干燥（不要太干，否则DNA不易溶解）。

9.取溶液F200μL ,混匀，40-50℃水浴5分钟。

10.12000rpm离心2分钟，上清即是实验动物基因组DNA。

（二） 电泳检测

由于基因组DNA分子质量较大，用0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，先在底部铺一层1%的支持胶，凝固后在铺上一层0.3%琼脂糖凝胶，插上梳子（不能碰到支持胶）。取1.5μL溶解的DNA、1μL上样缓冲液和3.5μL无菌水混匀后小心上样观察基因组DNA大小。

六、注意事项

1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。
 

(责任编辑：大汉昆仑王)