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        角质形成细胞的原代培养方法

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        人角质形成 c 方法

        A. 从新生儿包皮分离出表皮角质形成细胞

        1. 在包皮环切术中,包皮放置于含有庆大霉素(Cat.No.15710)(浓度为5ug/ml)的Dk-SFMZ中。包皮可保存于2~8°C直到需要使用时。(注意:人类包皮可以保存于此种物质中2~8°C约5天而不会明显失去细胞活性。)

        2. 包皮放置于含有庆大霉素(浓度为20ug/ml)的DPBS(不含Ca 2+ or Mg 2+ )(Cat.No.14190)冲洗液中约1小时。包皮剪成2~4块并转移到酪蛋白溶解的25.0单位/ml的dispase(Cat.No.17105)DPBS溶液中(添加5ug/ml的庆大霉素),在2~8°C条件下孵育18小时。

        3. dispase孵育后,人角质形成细胞的表皮层从真皮层分离下来,转移到加有5~10ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA(Cat.No.25300)的60mm有盖培养皿中。在36°C± 2°C条件下孵育大约15分钟,在这个过程中,每2~3分钟使用2ml的移液管吹打以帮助细胞解离。

        4. 孵育以后,胰蛋白酶活性使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Cat.No.17075)终止,大豆胰酶抑制剂终浓度为10mg/ml使用DPBS(不含Ca 2+ or Mg 2+ )配置,并在使用前无菌过滤。细胞悬液转移到15ml无菌离心管,在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。

        5. 角质形成细胞使用5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液,并使用血细胞计数器计算角质形成细胞浓度。原代细胞大约3×10 6 放入75cm 2 组织培养瓶中,并加入15ml完全培养基。 细胞培养 :松弛的瓶盖,36°C ± 2°C,5% CO 2 的潮湿空气中。

        6. 角质形成 细胞培养 液约每2~3天更换一次。

        7. 由于原代角质形成细胞在供者之间生长特性的差异性,原代培养可能需要6~10天才能达到60%~75%的融合。

        B. 人表皮角质形成细胞的传代

        1. 达到60%~75%的融合后,移去培养基,单层细胞使用10ml 1:5000乙二胺四乙酸(Versene)冲洗。1~2ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA加入培养瓶中在36°C ± 2°C孵育5-10分钟。当细胞开始变圆时,移除胰蛋白酶,在36°C ± 2°C再次孵育。

        2. 当大约90%细胞分离时,使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。细胞悬液转移到15ml无菌离心管,在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。

        3. 角质形成细胞使用3~5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液,细胞大约1~3×10 6 放入75cm2组织培养瓶中,并加入15ml完全培养基。

        4. 细胞培养 : 36°C ± 2°C,5% CO 2 的空气中。角质形成 细胞培养 液约每2~3天更换一次,当达到60%~75%融合后,即可进行传代。

         

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