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        血小板活化检测方法

        互联网

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        1. 临床意义

        心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在中国有很高的发病率,也是致死的重要原因。血小板活化是血栓形成的重要环节,检测血小板的活化状态可辅助诊断和监控血栓性疾病,对判断血栓前状态意义也非常重大。

        2. 检测原理

        静止状态的血小板内分布着多种颗粒,如a颗粒、溶酶体颗粒等。这些颗粒表面存在着一些特定蛋白,如a颗粒表面有CD62p抗原,溶酶体颗粒表面有CD63抗原。血小板活化时,由于颗粒膜蛋白与血小板膜蛋白相互融合,使颗粒膜蛋白翻转到血小板膜表面。因此,可通过检测这些颗粒膜蛋白来判断血小板的活化状态。

        3. 采血

        EDTA抗凝采血,取后段血。因前段血中可能有组织液存在,造成人为血小板活化。

        4. 试剂 选择

        FITC标记的CD42b抗体
        PE标记的CD62p或CD63抗体
        在血小板膜表面稳定表达的抗原有CD41/CD61(GPIIb/IIIa)和CD42a, CD42b等,这些抗原均可作为血小板的标志。但因中国存在着一部分血小板无力症患者,其血小板表面缺乏CD41/CD61(GPIIb/IIIa)。因此,一般使用CD42b来鉴别血小板。
        因一般情况下,CD62p和CD63的表达率均较低,需用PE等荧光较强的荧光素标记检测。

        5. 染色

        a. 全血法:

        1) 取 试管 A(阴性对照)和 试管 B(测定管),均加入5ml 抗凝全血和200ml PBS
        2) A管中加入适量的CD42b-FITC和阴性对照抗体(对应于CD62-PE或CD63-PE)
        B管中加入适量的CD42b-FITC和CD62-PE或CD63-PE抗体
        3) 室温,避光孵育25分钟
        4) 加2 ml PBS,上机检测
        血小板在体外随着时间的延长会自发活化,所以由采血到检测一般要在3小时内完成。

         

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