单克隆抗体细胞融合实验
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2036
（一）融合剂
细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。
聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。
也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。
不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。
单克隆抗体制备过程示意图
（二）融合过程
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。
1． 试剂 与材料
(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
(2) 1640培养液100ml。
(3) 完全1640液100ml。
(4) 2.5％FCS－1640液50ml。
(5) HAT培养液100ml。
(6) 50％PEG：取分子量4 000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
(8) 40孔塑料培养盘。
2．操作方法
⑴ 准备好脾细胞。
⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。
⑶ 室温400g离心3min，使细胞沉淀。
⑷ 移去上清液。
⑸ 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。
⑹ 加预热至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。
⑺ 加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。
⑻重复⑺一次。
⑼ 加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min。
⑽ 重复⑼一次。
⑾ 加1640液15ml。
⑿ 室温，400g离心1min，使细胞沉淀。
⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。
⒂ 轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。
⒃ 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。
⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用 倒置显微镜 观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查 抗体 。
⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查 抗体 ，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。
（三）细胞融合的关键
1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。
２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。
聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。
也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。
不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。
单克隆抗体制备过程示意图
（二）融合过程
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。
1． 试剂 与材料
(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
(2) 1640培养液100ml。
(3) 完全1640液100ml。
(4) 2.5％FCS－1640液50ml。
(5) HAT培养液100ml。
(6) 50％PEG：取分子量4 000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
(8) 40孔塑料培养盘。
2．操作方法
⑴ 准备好脾细胞。
⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。
⑶ 室温400g离心3min，使细胞沉淀。
⑷ 移去上清液。
⑸ 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。
⑹ 加预热至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。
⑺ 加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。
⑻重复⑺一次。
⑼ 加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min。
⑽ 重复⑼一次。
⑾ 加1640液15ml。
⑿ 室温，400g离心1min，使细胞沉淀。
⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。
⒂ 轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。
⒃ 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。
⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用 倒置显微镜 观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查 抗体 。
⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查 抗体 ，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。
（三）细胞融合的关键
1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。
２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
