动物细胞微丝束的光学显微镜观察
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实验十 动物细胞微丝束的光学显微镜观察
细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构，主要包括微管（microtubule，MT，20~25 nm）和纤丝（filament）两大类；另外，胞质中还散布着一些3~6 nm的细小纤维。按纤维的直径、组成成分以及组装结构的不同，纤丝又可分为微丝（microfilament，MF）、中间丝（intermediate filament，IF）和粗丝（thick filament，TF）三类。微丝是肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维（F-actin），直径为6~7 nm，又名肌动蛋白丝，其长度不定，多分布在近细胞膜的下方。微丝在不同种类的细胞中，它们又与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构，如张力纤维（stress fiber）、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。现在观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段。本实验用考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue R250）显示微丝组成的张力纤维。张力纤维在体外培养细胞中普遍存在，于活体内哪些细胞具有张力纤维研究得还比较少，比较明确的是，一些迅速运动的细胞如巨噬细胞、变形虫等缺乏张力纤维。张力纤维的组成除了肌动蛋白外，还有肌动蛋白结合蛋白如α-辅肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白等沿着张力纤维的轴向进行周期性地分布，类似于肌原纤维的组织分布，并具有收缩功能。
实 验 目 的
1. 掌握考马斯亮蓝R250染动物细胞胞质微丝的方法。
2. 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。
实 验 原 理
考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。
染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca 2+ 离子，溶液中并提供Mg 2+ 离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。
实 验 用 品
一、材料 体外培养的动物细胞。
二、试剂 生物秀细胞实验论坛交流
1. 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法
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0.2mol/L Na 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 缓冲液(pH7.3) |
50 ml |
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NaCl |
0.15 mol/L |
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重蒸馏水 |
至1000 ml |
其中PB的配法: 0.2mo1/L Na 2 HPO 4 77 ml
0.2mo1/L NaH 2 PO 4 23 ml
2. M-缓冲液
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咪唑(imidazole, pH6.7) |
50 mmol/L |
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KC1 |
50 mmol/L |
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MgCl 2 |
0.5 mmol/L |
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EGTA |
l mmol/L |
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EDTA |
0.l mmol/L |
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巯基乙醇(mercaptoethanol) |
l mmol/L |
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甘油 |
4 mmol/L |
用1 mol/L HCl调pH至7.2。
3. 1%的Triton X-l00/M-缓冲液
