动物细胞微丝束的光学显微镜观察

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细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构，主要包括微管(microtubule，MT，20~25 nm)和纤丝(filament)两大类;另外，胞质中还散布着一些3~6 nm的细小纤维。按纤维的直径、组成成分以及组装结构的不同，纤丝又可分为微丝(microfilament，MF)、中间丝(intermediate filament，IF)和粗丝(thick filament，TF)三类。微丝是肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维(F-actin)，直径为6~7 nm，又名肌动蛋白丝，其长度不定，多分布在近细胞膜 的下方。微丝在不同种类的细胞中，它们又与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构，如张力纤维(stress fiber)、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。现在观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段。本实验用考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250)显示微丝组成的张力纤维。张力纤维在体外培养细胞中普遍存在，于活体内哪些细胞具有张力纤维研究得还比较少，比较明确的是，一些迅速运动的细胞如巨噬细胞、变形虫等缺乏张力纤维。张力纤维的组成除了肌动蛋白外，还有肌动蛋白结合蛋白如α-辅肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白等沿着张力纤维的轴向进行周期性地分布，类似于肌原纤维的组织分布，并具有收缩功能。

实 验 目 的

1. 掌握考马斯亮蓝R250染动物细胞胞质微丝的方法。

2. 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。

实 验 原 理

考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管;还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫 细胞化学等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。

染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA 螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。

实 验 用 品

一、材料 体外培养的动物细胞。

二、试剂

1. 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法

0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3) 50ml;

NaCl 0.15mol/L;

重蒸馏水至1000ml

其中PB的配法: 0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml

0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml

2. M-缓冲液

咪唑(imidazole, pH6.7)50mmol/L;

KC1 50mmol/L;

MgCl2 0.5 mmol/L;

EGTA l mmol/L;

EDTA 0.l mmol/L;

巯基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L

甘油 4 mmol/L

用1 mol/L HCl调pH至7.2。

3. 1%的Triton X-l00/M-缓冲液

4. 0.2%考马斯亮蓝R250染液，溶剂是:

甲醇 46.5ml;

冰醋酸 7ml;

蒸馏水 46.5ml

5. 30%戊二醛-PB溶液，pH7.2

三、器材 显微镜、载玻片、35mm小染缸。

实 验 方 法

细胞培养在盖玻片上，生长密度达++~+++时取出

↓

PBS液轻轻涮洗

↓

l% TritonX-l00/M-缓冲液处理l5min(室温或37℃)

(Triton X-l00是非离子型表面活性剂(去污剂)，能增加细胞膜通透性并抽提部分杂蛋白质，使骨架图像更清晰)

↓

M-缓冲液轻轻洗细胞3次(稳定细胞骨架)

↓

3%戊二醛-PB液固定细胞5~l5min

↓

PBS液洗细胞若干次

↓滤纸吸干

0.2%考马斯亮蓝R250染片30min

↓

小心地用水漂洗

↓

空气干燥

↓

直接观察或用树脂封片

实 验 结 果

用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布。在成纤维样细胞如CHO、包皮等细胞中，纤维沿细胞长轴排列:而在上皮样细胞，如HeLa等，因细胞呈多边形，张力纤维有交叉，沿不同方向跨越胞体伸向细胞突起处或粘着斑处。

注意：张力纤维是一动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型;反之，张力纤维收敛略现弯曲;当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。