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        牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验

        互联网

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        (一)材料及试剂
        1.器材
        ⑴细胞培养板:灭菌的国产96孔或40孔平底聚苯乙烯塑料板或进口96孔 细胞培养 板。
        ⑵50μl、100μl、300μl微量加样器,灭菌的塑料滴头。
        ⑶无菌透明胶带,其密度与塑料板一致。
        ⑷灭菌的离心管
        ⑸倒置显微镜
        2.IBR Baitha—Nu/67弱毒株冻干毒,标准阳性血清,标准阴性血清,均由指定单位供应。
        3. 细胞培养 液
        Eagles MEM 45%
        0.5%水解乳蛋白-Earle液 45%
        犊牛血清 10%
        谷氨酰胺 0.03%
        青、链霉素各200μg/ml
        用7%NaHCO 3 液调pH6.8~7.0。
        (二)操作方法
        1.细胞制备 灭菌采取犊牛肾或睾丸,按常规胰蛋白酶消化法制备牛肾(BK)或睾丸(BT)细胞,置37℃温箱培养,长成良好单层细胞备用。一般使用次代细胞,但不超过4代。
        2.病毒抗原制备 将IBR Baitha—Nu/67弱毒株冻干毒用LE(0.5%水解乳蛋白—Earle液)作10倍稀释,取长成良好的单层细胞(BK或BT),用Earle’s液洗一次后,按原培养液1/10的量接毒。置37℃温箱吸附1h,然后加入pH7.1~7.2含青、链霉素200g/μgml的LE液至原培养液量,37℃培养,待80%~90%出现典型IBR病变时收获培养物,冻融2次后,3 000r/min离心10min,其上清即为病毒抗原。测定病毒滴度(TCID)并分装小瓶,贮于-70℃备用。半年内滴度保持不变。
        3.病毒滴度测定 将制备的病毒抗原,用pH7.0~7.2的LE液作10倍递增稀释至10-7,每病毒稀释滴度液接种细胞培养板4孔,每孔50μl,随后每孔加入细胞悬液(50~60万细胞/ml)10μl和 细胞培养 液50μl。设4孔细胞对照。用透明胶带封板,置37℃培养。观察1周,每天记录细胞病变情况。
        细胞培养 半数感染量(TCID 50 )的确定按Reed-Muench方法计算,即:
        TCID 50 =高于50%死亡率的病毒稀释度的对数+距离比值×稀释倍数(10)的对数。

        4.无菌采集被检血清,不加任何防腐剂。各种血清均56℃灭能30min。
        5.将一瓶已知滴度IBR病毒抗原,用pH7.0~7.2的LE液稀释成100TCID 50 /0.05ml,取0.3ml与等量的被检血清于小试管中,37℃温箱中和1h。
        6.将已中和的被检血清—病毒混合液加入培养板孔中,每个样品接种4孔,每孔100ul。再于每一样品孔中加入100μl细胞悬液,用透明胶带封板,37℃培养。
        7.每次试验时,均设立以下对照:
        (1) 标准阳性血清+抗原,标准阴性血清+抗原,其操作程序同试验组。
        (2) 被检血清毒性对照:每份被检血清样品接种2孔,每孔50μl,补加 细胞培养 液50ml,再加细胞悬液100μl。
        (3) 细胞对照:每孔加100μl细胞悬液,补加 细胞培养 液100μl。
        (4) 实际使用病毒抗原工作量的测定:将病毒抗原工作溶液(100TCID 50 /0.05μl)作10倍递增稀释至10-3,每个稀释度接种4孔,每孔50μl,补加 细胞培养 液50μl,再加细胞悬液100μl。计算本次试验每0.05ml中TCID 50 的实际含量。
        (四)结果判定
        1.接种后72h判定结果 当病毒抗原工作液对照、标准阴性 血清 对照均出现典型细胞病变。标准阳性 血清 对照无细胞病变,被检血清对细胞无毒性,细胞对照正常病毒抗原实际含量在30~300TCID 50 时,方能判定,否则被认为无效。
        2.判定标准 未经稀释的被检血清能使50%或50%以上细胞孔不出现病变者判为阳性。
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