• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        微量快速平板法抗补体试验

        互联网

        1449

        实验试剂

         

        抗凝保存液中保存的绵羊红细胞、马抗绵羊红细胞抗血清(溶血素)、pH值7.4巴比妥缓冲液、聚合IgG、0.04%氨溶液。

        实验设备

         

        12×8孔的U型微量板、稀释器(50μl)、分液器、离心机(MSE 6 L,可使U型微量板离心)、72型分光光度计等。

        实验步骤

         

        1. 致敏绵羊红细胞的制备

           1) 将5ml抗凝保存液中的红细胞2 500 r/min离心5min;

           2) 弃去上清液,沉淀细胞用pH值7.4巴比妥缓冲液应用液洗涤3次,每次3 500 r/min离心5min;

           3) 吸取0.9ml洗涤过的压积红细胞加入上述缓冲液配成6%红细胞悬液;

           4) 为了使红细胞标准化,取0.2ml稀释的红细胞悬液加入4.8ml 0.04%氨溶液,在72型分光光度计(波长541nm,比色杯为1cm),以蒸馏水作空白,读数;

           5) 根据以下公式调整6%红细胞悬液的体积(V):

           V体积(ml)=15×光密度0.49

           V-15=还需加入6%红细胞悬液中的缓冲液毫升数。

           6) 于上述1.5ml 6%红细胞悬液中加入1.5ml 1∶150稀释的溶血素,充分混匀后,37℃水浴15~20min,此种3%致敏绵羊红细胞,可于4℃保存过夜,使用前,再经37℃水浴保温。

        2. 豚鼠补体的滴定

           1) 于冷冻干燥的豚鼠补体中,加蒸馏水至原来体积,室温放置5min,轻轻混匀,避免产生气泡;

           2) 将上述豚鼠补体用pH值7.4巴比妥缓冲液应用液作1∶10稀释,轻轻混和,避免产生气泡;

           3) 将1∶10豚鼠补体作进一步稀释,充分混匀,避免产生气泡;

           4) 用分液器从每个补体稀释度中取50μl移至U型微量板的一行相应孔中(每行8孔),第8孔加入50μl、pH值7.4巴比妥缓冲液应用液作对照。具体操作时先加入缓冲液对照,然后从最高稀释度开始按顺序加入不同稀释度的补体;

           5) 在U型微量板各孔中加入100μl、pH值7.4巴比妥缓冲液应用液及50μl致敏绵羊红细胞;

           6) 在微量板上放置一块玻璃板,周围用胶布密封,以避免液体蒸发,37℃温箱内放置1h,每20min混匀一次;

           7) 于室温再放置3~4h,使红细胞自然沉降,或用MSE 6 L离心机2000 r/min离心5min;

           8) 观察结果,对照孔应不溶血,在一般情况下,1∶40补体稀释孔应完全溶血。以恰好能使致敏红细胞完全溶血的最高补体稀释度作为补体滴度,称为最小溶血量(MHD),补体滴度通常为1∶60~1∶80,偶而可达1∶130。

        3. 抗补体活性测定

           1) 在U型微量板上按序号,每份被检标本一行(12孔),另一行作为对照,分别加入50μl pH值7.4巴比妥缓冲液应用液;

           2) 第1孔加入50μl被检标本,用稀释器将标本依次作倍比稀释,从1∶2~1∶4.096。从最后1孔中弃去50μl。另将聚合IgG 50μl加于对照行的第一孔中,同法作倍比稀释;

           3) 每孔中加50μl pH值7.4巴比妥缓冲液应用液;

           4) 每孔中再加入2MHD豚鼠补体(如1MHD=1∶80,2MHD=1∶40);

           5) 在微量板上放一块玻璃板,周围用胶布密封,4℃放置16~18h;

           6) 加入50μl致敏绵羊红细胞,再用胶布密封;

           7) 37℃保温1h,每20min混匀一次;

           8) 室温再放置2~5h或用MSE 6 L离心机2000 r/min离心5min;

           9) 根据孔底沉降红细胞状况,按以下五级标准记录结果:

           0级:完全溶血,无红细胞;

           1级:大约溶解75%红细胞;

           2级:大约溶解50%红细胞;

           3级:大约溶解25%红细胞;

           4级:无溶血。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序