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        白细胞介素6(IL-6)生物学活性检测

        互联网

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          ㈠ 原理:IL-6在体外能促进B细胞杂交瘤的生长,故又称为杂交瘤生长因子(HGF)。小鼠B细胞杂交瘤7TD1是一株对IL-6依赖的细胞系,由Van Snick 1986年建立,只有在IL-6存在的培养基中才能生长,可以作为指示细胞来测定待检样品中IL-6水平。这类IL-6依赖的小鼠B细胞杂交瘤细胞系还有MH60·BSF2、B9等。
          ㈡ 方法:主要为3H-TdR掺入法

              IL-6依赖的7TD1细胞用无FCS的RPMI1640洗涤2次
               每次1000rpm,5min,除去原培养液中的IL-6
                        ↓
        用10%FCS-RPMI1640调整活细胞数2×104/ml
                        ↓
        96孔平底培养板中每孔加100μl 7TD1悬液(2×103/孔)
                        ↓
                加入不同稀释度标准IL-6和待检样品(100μl/孔)
                        ↓
                37℃,5%CO2孵箱培养48~72h
                        ↓
                每孔加3H-TdR 0.5μCi/50μl
                        ↓10h
        用多头细胞收集仪收获于玻璃纤维滤纸上
                        ↓
        干燥后移入液闪瓶中,加入1ml闪烁液,于液闪仪中测β射线的cpm值。
          计算:
          1. 根据cpm值,将能使7TD1细胞3H-TdR掺入cpm值达到最大值50%的IL-6的活性定为1u/ml。
          2. 以刺激指数(SI)表示。
          ㈢ 试剂 和器材
          1. IL-6依赖的7TD1细胞系
          2. 10%FCS-RPMI1640及无FCS的RPMI1640
          3. 3H-TdR
        4. 标准IL-6
        5. PPO,POPOP,二甲苯。
          6. 9999型玻璃纤维滤纸。
          7. 96孔平底培养板
          8. 多头细胞收集仪
          9. CO2孵箱
          10. β液闪计数仪
          ㈣ 注意事项:
          1. 7TD1细胞洗涤要充分、轻柔,每次弃洗涤上清力求彻底。
          2. 避免 同位素 污染。
          3. 加样品时,应从低浓度到高浓度顺序加。


          4. 加入3H-TdR最适时机是阴性对照95%以上死亡。
          5. 为了增加检测方法的敏感性,可采用新复苏7TD1细胞,或用pH4.0枸椽酸 缓冲液 处理培养状态的7TD1细胞。

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