• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        白细胞介素-1生物学活性检测

        相关实验:细胞因子生物学活性检测实验

        最新修订时间:

        原理

        白细胞介素1是一种重要的细胞因子,主要由单核-巨噬细胞产生,IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能,而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。

        一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性
         
        小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体,在有IL-1同时存在的条件下,IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。根据加入IL-1后增殖水平(3H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位,或计算出刺激指数。

        二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活
         
        小鼠胸腺瘤细胞系EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体,在IL-1诱导下产生高水平的IL-2,通过用IL-2依赖株CTLL-2检测IL-2的生物学活性,从而反映检测样品中IL-1的水平。

        材料与仪器

        步骤

        一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性

        1.  取6~8 周龄C57BL16小鼠,拉颈处死,无菌取胸腺置不锈钢网筛上,用注射器针蕊研磨成细胞悬液调整细胞数为1.5×107 /ml
                        
        2.  细胞悬液内加入ConA,使终浓度为3 μg/ml,在96孔培养板中加100 μl(1.5×106细胞)
                          
        3.  加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品100 μl/孔(ConA终浓度为1.5 μg/ml),37 ℃  CO2孵箱 66 h
                    
        4.  每孔加3H-TdR 0.5 μci,
        37 ℃ CO2孵箱 6 h
                
        5.  多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上
                          
        6.  烤干,移入液闪瓶中,加适量闪烁液,于液闪仪上测β计数
         
        7.  计算


        (1)从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位
          
        (2)也可用刺激指数(SI)表示

         
          实验组cpm
        SI=────── ×100%
             对照组cpm

        二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活
         
        1.  用EL4细胞两步法检测IL-1活性
                
        (1)收集处于对数生长期的EL4细胞
                       
        (2)洗涤后,用1 %FCS RPMI1640重悬细胞,并调整细胞浓度2×106 /ml
                        
        (3)加处96孔板中,100 μl/孔
                       
        (4)加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β,100 μl/孔,同时设1 %FCS RPMI 1640对照
                        
        (5)5 %CO37 ℃培养18~24 小时
                       
        (6)按终稀释度为1∶10~20转入另一块96孔板中
                        
        (7)用CTLL-2 检测IL-2活性、检测方法见"IL-2检测"

        2.  用EL4细胞一步法检测IL-1活性
                
        (1)用5 %FCS RPMI 1640调整
        EL4细胞浓度至2×105 /ml,CTTL-2浓度至4×105 /ml
         
        (2)加入96孔板中,两种细胞各加50 μl/孔
                           
        (3)加入不同稀释度的IL-1或待测样品,同时设EL4和CTLL-2细胞对照
                      
        (4)置5 %CO2,37 ℃培养24~28 小时后加入3H-TdR,0.5 μci/50 μl/孔,继续培养6~8 小时
                          
        (5)收集样品,β计数

        注意事项

        一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性

        1.  不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异,据国内资料报道以C57BL为好。
         
        2.  不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一,一般选用6~8 周龄,小于5 周或大于10 周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。
          
        3.  ConA促丝裂原作用要进行预试,一般采用亚适剂量。


        二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活
         
        1.  在一步法检测IL-1时,其EL4细胞浓度不宜超过1×104 /孔,血清终浓度应<
        5%。
          
        2.  在二步法检测IL-1时,其EL4细胞浓度在2×105 /孔时,转移上清稀释度
        不宜低于1∶8,其诱导时间应12~24 小时间为佳。诱导血清浓度应≤1%。
          
        3.  在检测经诱导的上清中IL-1时,应避免使用A23187,TPA和ConA等较强的能
        诱导EL4细胞产生IL-2的诱导剂来刺激IL-1的产生。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序