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        基因组合生物合成新化合物

        互联网

        1789

        实验目的
        组合生物合成是将不同化合物的生物合成基因重新组合后,形成新的生物合成途径,从而产生新的化合物,这是新药研究中的重要进展。

        目前许多具有生理活性的天然产物的生物合成途径已经研究清楚,利用组合生物合成技术通过改变聚酮合成酶的基因合成了一系列“非天然的”的聚酮类化合物库,以供进一步的活性筛选。本实验利用微生物中的聚酮体生物合成基因重组,产生新的化合物。

        实验原理
        加利利链霉菌ATCC31671产生2-羟基阿克拉菌酮(2-hydroxyaklavinone)。将含有聚酮体酮基还原酶(polyketide ketoreductase,PKR)的质粒pWX03转入加利利链霉菌ATCC31671,可以产生阿克拉菌酮(aklavinone)。

        第一部分 链霉菌质粒DNA提取

        实验材料和试剂
        菌种:质粒pWX03(含PKR)/变铅青链霉菌(S. lividans TK18)。
        溶液:1.溶菌酶溶液:0.3mol/L 蔗糖
        25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
        25mmol/L EDTA(pH8.0)
        2mg/ml 溶菌酶
        2.碱性裂解液:0.3mol/L NaOH
        2% SDS
        3.7.5mol/L NH4Ac溶液
        4.TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
        1mmol/L EDTA(pH8.0

        实验步骤
        1.从含质粒pWX03的变铅青链霉菌(S. lividans TK18)斜面上挖块接种到20ml R2YE培养基(补加硫链丝菌素至作用浓度为25mg/ml)中。28℃ 200r/min 培养48小时。
        2.取菌液1ml于eppendorf管中,3000r/min离心5分钟,收集菌体。
        3.将菌体悬浮于500ml溶菌酶溶液中,37℃水浴中保温。每隔5分钟取一滴溶菌悬浮液于载玻片上,加入一滴碱性裂解液时,会变成透明粘稠为止。(如果发现不粘稠,则是DNA已经降解,最好用新鲜的菌丝重做。)
        4.加入250ml碱性裂解液,迅速颠倒混匀,置65℃水浴中保温10~15分钟,取出在冰上放置3分钟。
        5.加入380ml 7.5mol/L NH4Ac溶液,混匀,冰上放置10分钟。10,000 r/min离心10分钟。
        6.将上清液转移到二个新eppendorf管中,每管约500 ml。
        7.加入1000 ml无水乙醇,混匀,-20℃放置60分钟,沉淀DNA。
        8.10,000rpm离心10分钟,弃上清。干燥,沉淀溶于20 ml TE缓冲液中。合并二管DNA样品到一个管中。
        取10 ml DNA样品,琼脂糖凝胶电泳检查

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