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        采用合成肽组合库鉴定 B 细 胞 和 T 细胞的表位

        相关实验：抗肽的抗血清制备以及从多肽库中筛选 B、T细胞抗原表位

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

         

        基 本 方 案 1 采 用 PS-SCL 筛选抗体抑制剂

        材 料

        肽或蛋白质抗原

        目的抗原的单克隆抗体（M A b )

        1 % (m/V) BS A / P B S (见附录 1PBS)

        六 肽 的 PS-SCL ( 表 13. 3.1): 5 m g / m l 的 1 2 0 肽 混 合 物（若 需 详 细 资 料 ，联系C. Pinilla9 cpinilla@tpims.org)

        辣 根 过 氧 化 物 酶（ H R P ) 偶 联 M A b 的 同 种 型 抗 体 的 特 异 性 的 抗 鼠 抗 体（Calbioc h e m ; 按生产商提供的说明书使用）

        显影液

        4mol/L 硫酸

        结合能力较强的聚苯乙烯 9 6 孔 微 量 滴 定 板（如 A / 2 板 ， Costar; Immunolon 4 板 ，Dynatech)

        保湿盒：用湿纸巾密封的 Tupperware 盒

        带 有 4 9 2 n m 滤光片的 9 6 孔微量滴定板读板仪（酶联仪）

        1 . 通过抗原-抗体结合的直接和竞争性 E L I S A (见辅助方案）选择最佳的抗原和单抗浓度用于筛选检测。

        2 . 加 入 50^1/孔的优化浓度的肽或蛋白质抗原包被 9 6 孔板。每种肽复合物做 2 个复孔。若 每 板 有 8 0 个 样 孔（图 13. 3 . 1 ) 则 准 备 三 个 板 检 测 P S - S C L 的 120 肽复合物。在37°C 下的保湿盒中孵育 2 h 或在室温条件下放置过夜 （18 h )。

        3 .翻转滴定板并弃去液体，用水清洗滴定板 1 0 次 。将滴定板在纸巾上拍击以除去残留
        图 13. 3 . 1 竞 争 性 ELISA筛 查 80肽 混 合 物 设 计 示 意 图 。 包 被 有 抗 原 的 96孔 微 量 滴 定 板 加 人 抗 体 和 肽 混 合 物 后 孵 育 检 测 混 合 物 的 抑 制 活 性 。 肽 混 合 物 在 第 二 块 板 上 重 复 检 测 ； 每 一 行 都 包 括 只 含 有 抗 体 的 孔 （一 ； 第 一 列 ） 和 含 有 目 的 抗 原 与 抗 体 混 合 物 的 孔 （+ ; 第 二 列 ） （抗 原 在 每 一 列 中 做 2 倍 的 连 续 倍 比 稀 释 ）。 的水。不要让孔内过于干燥。 4 . 每孔加入100/xll% 的 B S A /P B S ，在 37°C 下的保湿盒中孵育l h ，封闭未特异结合的 位点。 5 . 按 步 骤 3 清洗各孔。添 加 25^1肽 复 合 物 （1〜5m g /m l ) 或 图 13. 3.1所示浓度的抗原 对照到相应的孔内。再向每孔内加入25M 1适 宜 浓 度 的 M A b 。 4°C 下的保湿盒中孵育 18h 或 在 37°C 下 孵 育 l h 。 6 . 清洗各孔并加入50M 1/孔 的 H R P 偶联的抗鼠的抗体。 37°C 下保湿盒中孵育l h 。 7 . 清洗各孔并加人50^1/孔的显色液。室温条件下在暗室内放置10〜15miri。最后向每 孔 添 加 25M 1硫酸停止反应。 8 . 在 A 492波长下用酶联仪检测，若 发 现 肽 复 合 物 在 A 492下读数较低，说明活性抑制。 可有选择地计算每块板中各个肽复合物与第一列中所对应的对照抗原的抑制率。 9 . 通过竞争性E L I S A 再次检测具> 3 0 % 〜5 0 % 抑制性的肽复合物（步 骤 2〜8)，使用 4 组连续的2 倍比肽复合物的稀释液。若肽复合物具> 5 0 % 的抑制性，则 使 用 8 份连 续 的 2 倍比稀释液检测。 10. 参 照 5 0 % 的 抗 体 结 合 值 （IC5Q) ，确定抑制性肽复合物的浓度，并 挑 选 出 IC5。值最 低活性最强的肽复合物。 11. 为 每 6 个氨基酸位点挑选活性最高的肽复合物。在选出的肽复合物的固定位点上的 氨基酸的基础上，合成与这些氨基酸相关的所有可能组合的联合体的单个肽。对已 知序列的免疫原，找出其抗体所识别的抗原决定簇。 12. 通过单个肽的竞争性E L I S A 实验验证P S -S C L 的筛选结果，并鉴定其特异的抗原决 定簇或高亲和性配体。 基 本 方 案 2 筛 查 PS-SCL鉴 定 CD4 + 或 CD8+ T 细胞的配体 注 ：除非有特别的说明，所 有 孵 育 过 程 都 应 在 37°C ， 5 % C O 2 的培养箱中进行。 与活细胞处理相关的所有试剂或仪器必须是无菌的
        材料 T 细 胞 克 隆 （T C C ) 十 肽 P S - S C L (表 13. 3.2): 200肽 复 合 物 （若需详细资料，联 系 C .Pinilla， cpinilla@ tpims.org) 抗 原 呈 递 细 胞 （A P C ) 和合适的培养基 [3H ] 胸腺嘧啶 N a 251C r O 4 (用于铬释放检测） 检测 I N F -7 的 E L I S A 试 剂 盒 （PharMingen) 9 6 孔圆底微量滴定板（Costar) C D 4+增殖检测所需的细胞收集器和卩液闪仪 检测细胞毒实验的7 计数器或检测所标记的靶细胞释放出的荧光的高敏感度荧光计 1 . 培 养 T C C 达到必要的细胞数 （5 X 106〜 IOOXlO6个细胞数用于筛选一个十肽库）。 2 . 针 对 每 个 十 肽 P S -S C L 的 2 0 0 肽 混 合 物 检 测 T C C 的 增 殖 （C D 4 + ) 或细胞毒 (C D 8 + ) 反应。所有的反应都设定2 个 复 孔 （需 要 5 个 9 6 孔板）。 3 . 将 0.1m l 的 T C C 细胞混悬液加入9 6 孔板，孔内已事先加入适量的A P C 和肽混合物 (终 浓 度 O.l m g /m l ; 因为细胞毒性问题不推荐高浓度）。将 细 胞 和 P S -S C L 在 37°C 共 培 养 24〜72h 或 4h 用于51C r 释放试验。 4 . 测定针对 T C C 的肽混合物的活性，选用适合于细胞类型和每种T C C 的检测方法。 a. C D 4+ T 细 胞 增 殖 ：见 单 元 8.8。在 细 胞 孵 育 的 最 后 8h 每 孔 加 入 0.25〜 lM Ci 3H T d R 。收集细胞并用(3液闪仪测定掺和的放射性。 b. C D 8+ T 细胞的51C r 释放检测：见 单 元 2. 10。从 每 孔 内 取 出 150M 1到计数杯或另 一培养板，测定释放到上清液中的放射源比例。 c. C D 8+ T 细胞 的 I F N -7产物 ：见 单 元 5.7。将上清液转移到包被抗干扰素单克隆抗 体的培养板。特 定 的 E L I S A 试剂盒检测。 重复实验验证结果。 5 . 将最具活性肽混合物中的已确定的氨基酸与P S -S C L 的每个位点结合，在库筛查所 得的结果基础上设计并鉴定肽。 6 . 通过生物测定学分析，比较从十肽库中获取的系统的数据与蛋白质库中的肽序列， 来检测天然的或潜在的交叉反应的配体。 7 . 用从十肽库或蛋白质库中推断出的结果合成每条肽链。测定各个肽的活性。 辅 助 方 案 优 化 用 于 筛 查 的 抗 原 和 抗 体 浓 度 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 肽或蛋白质抗原：一样品溶于P B S 而另一样品溶于碳酸氢盐缓冲液（肽长度< 1 0 个残基的需连接到一个大的蛋白质上） V P B S V 碳酸氢盐缓冲液， P H 9. 6
        肽或蛋白质抗原特异性的单克隆抗体（M A b ) 针对同型M A b 的特异性的辣根过氧化酶（H R P ) 偶 联 的 二 抗 （Calbiohem) ， 按生 产商的说明书溶于1 % B S A / P B S n/ 显色液 4mol/L 硫酸 结合性较强的聚苯乙烯9 6 孔 微 量 滴 定 培 养 板 （如 A /2， Costar; Immunolon 4, Dynatech) 湿盒：铺放湿纸巾的密封的Tupperware盒 带 有 492n m 滤光片的酶联仪 1 . 将 50M 1肽或蛋白质抗原的P B S 溶 解 液 加 至 A /2 9 6 孔培养板的第一列的一个孔内， 整个标准的9 6 孔培养板全部加IOOiUl/孔 。当合成肽的长度为10〜2 0 个残基时使用 的浓度为1〇〇 〜500ng/m l ; 当长度> 2 0 个残基时用的浓度为< 2 5 ng/m l 。对于蛋白质 抗原，使用浓度为1〜l〇M g/m l 。再将抗原溶于碳酸氢盐缓冲液。用稀释缓冲液将培 养板内的抗原做2 倍的倍比稀释，每 个浓度做2 个复孔。设置非特异性结合的对照 (单元1.1)。在 37°C 的湿盒中孵育2h 或在室温下孵育18h (过夜）。 比较P B S 和碳酸氢盐缓冲液的溶解结果来选择缓冲液以达到更好的效果。 2 . 倒掉孔中的液体并用水清洗各孔1 0 次。将培养板倒置在纸巾上拍击以除去残留的水 分 ，但不要让小孔过分干燥。 3 . 每孔添加100^x1的 1 % B S A /P B S 溶液封闭没有特异结合的位点。在 37°C 的湿盒中孵 育 I h0 4 . 同步骤2 清洗各孔。每孔添加 50M l M A b (lM g/m l ) 并 用 1 % B S A /P B S 在培养板上 设 置 2 倍的倍比稀释浓度。在 4°C 的湿盒中放置过夜。 5•清洗各孔并加入50M 1/孔 的 HRP偶联的二抗。在 37°C的湿盒中孵育l h 。 对 IgG特异性的 M A b ，要 使 用 HRP偶联的重链和轻链均具特异性的抗鼠的抗 体 。对不同型的M A b ，选择合适的二抗。 6 . 清洗各孔并加入50/xl/孔的显色液。室温条件下暗处放置10〜15m i n 。每孔加入25|ul 4mol/L 的硫酸终止反应，并用酶联仪检测A 492处光吸收值。 7 . 根据给出的最佳结果确定抗原和抗体的浓度（如最低的抗原和抗体浓度得出的A 492= 1.5〜2.0) 〇 8 . 用 步 骤 7 所确定的浓度的肽或蛋白质抗原的P B S 或磷酸钠盐稀释液50W /孔 包 被 96 孔板。在 37°C 的湿盒中孵育2h 或在室温下孵育18h (过夜）。 9 . 清洗各孔并添加lOOfd/孔 的 1 % B S A /P B S 溶液封闭没有特异结合的位点。在 37°C 的 湿盒中孵育l h 。 10.清洗各孔并加入25^1/孔 的 1 % B S A /P B S ，向第一行的第1〜3 孔内加入对照抗原 (含有相同数量的包被培养板的对照抗体）。再 向 第 4 〜 6 孔 和 7 〜9 孔分别加入 25^/孔 的 100X 和 1000X 的对照抗原。在培养板上设置2 倍的倍比稀释浓度。 10〜 1 2 列不含抑制剂代表1 0 0 % 的抗体结合。 1 1 . 向 第 1、 4 、 7 和 1 0 列 加 入 25M 1/孔的稀释到最佳浓度的M A b (步 骤 7 测定）。再向 2 、 5、 8 和 1 1 行 加 入 2 X 最佳浓度的抗体， 3、 6、 9 和 1 2 行 加 入 0.5X 最佳浓度的
        抗体。在 4°C 的湿盒中孵育18h 。 . 清洗各孔并加入50M 1/孔 的 H R P 偶联的二抗。在 37°C 的湿盒中孵育l h 。清洗各孔， 显影，按 步 骤 6 检测。 . 检测三种抗体1C % 时的抗原浓度。选 出 IC5。值最低且信噪比> 1 0 : 1 的抗体浓度。 利用这些条件筛选出肽库（见基本方案1 和 2)。

        ​

        来源：丁香实验

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