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        SDS-聚丙烯胺凝胶的制备方法

        互联网

        3216

        (一) 试剂
        1. 30%丙烯酰胺
        丙烯酰胺 29 g
        N,N’-亚甲双丙烯酰胺 1 g
        蒸馏 水 100 ml
        加热至50℃搅拌溶解,于4℃保存。
        2.10%SDS: 蒸馏 水配制,室温保存。
        3.10%过硫酸铵:蒸馏水配制,4℃保存,一周内使用。
        4.TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
        5.1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)
        6.电泳缓冲液
        25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
        250 mmol/L 甘氨酸
        0.1% SDS
        7.电泳加样缓冲液
        50 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)
        50 mmol/L 二硫苏糖醇( DTT )
        2 % SDS
        1 % 溴酚蓝
        10 % 甘油

        (二)操作
        1.将玻璃板和垫片依次用5%的KOH甲醇溶液、去污剂和清水洗涤,晾干。将无凹口的玻璃板平放在桌面上;将垫片两面涂少许凡士林后,排放在玻璃两侧,再将有凹口的玻璃板在垫片上放置妥当。将玻璃夹层推至桌沿,用胶带纸封闭三个侧面,留出有凹口的一面不封闭。
        2.使玻璃夹层竖立,有凹口面朝上。根据所需的凝胶浓度和用量,按表7-1的比例配制分离胶溶液
        3.一旦加入TEMED,混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,为积层胶留有足够空间。用吸管轻轻在其顶层加入几毫升异丁醇,以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
        4.聚合完成后(约30~60分钟)后,倒掉覆盖液体,用蒸馏水洗凝胶上部数次,尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残余液体
        5.根据所需用量,按表7-2的比例配制积层胶溶液。
        6.注入积层胶溶液,插入梳子,小心避免气泡,垂直放置于室温下。
        7.在积层胶聚合完成(约30分钟)后,小心拔掉梳子。用蒸馏水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺。
        8.将凝胶放入电泳槽中,上下槽均加入1×电泳缓冲液,检查是否泄漏。驱除两玻璃板之间凝胶底部的气泡,即可上样。

        表7-1 配制SDS-PAGE凝胶电泳分离胶浓度与所用溶液量

        溶液成分

        5~50ml凝胶溶液中各成分所需体积(ml)

        10

        15

        20

        25

        30

        40

        50

        12% 凝胶溶液

        H 2 0

        30%丙烯酰胺

        1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8)

        10%SDS

        10%过硫酸胺

        TEMED

         

         

        15% 凝胶溶液

        H 2 0

        30%丙烯酰胺

        1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8)

        10% SDS

        10%过硫酸胺

        TEMED

         

         

        3.3

        4.0

        2.5

        0.1

        0.1

        0.004

         

         

         

         

        2.3

        5.0

        2.5

        0.1

        0.1

        0.004

         

         

        4.9

        6.0

        3.8

        0.15

        0.15

        0.006

         

         

         

        3.4

        7.5

        3.8

        0.15

        0.15

        0.006

         

         

        6.6

        8.0

        5.0

        0.2

        0.2

        0.008

         

         

         

         

        4.6

        10.0

        5.0

        0.2

        0.2

        0.008

         

         

        8.2

        10.0

        6.3

        0.25

        0.25

        0.010

         

         

         

         

        5.7

        12.5

        6.3

        0.25

        0.25

        0.010

         

         

        9.9

        12.0

        7.5

        0.3

        0.3

        0.012

         

         

         

         

        6.9

        15.0

        7.5

        0.3

        0.3

        0.012

         

         

        13.2

        16.0

        10.0

        0.4

        0.4

        0.016

         

         

         

         

        9.2

        20.0

        10.0

        0.4

        0.4

        0.016

         

         

        16.5

        20.0

        12.5

        0.5

        0.5

        0.020

         

         

         

         

        11.5

        25.0

        12.5

        0.5

        0.5

        0.020


        表7-2 配制 SDS -PAGE凝胶电泳积层胶所用溶液量

        溶液成分

        1~10ml凝胶溶液中各成分所需体积(ml)

        1

        2

        4

        5

        6

        8

        10

        H 2 0

        30%丙烯酰胺

        1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8)

        10%SDS

        10%过硫酸胺

        TEMED

        0.68

        0.17

        0.13

        0.01

        0.01

        0.001

        1.4

        0.33

        0.25

        0.02

        0.02

        0.002

        2.7

        0.67

        0.5

        0.04

        0.04

        0.004

        3.4

        0.83

        0.63

        0.05

        0.05

        0.005

        4.1

        1.0

        0.75

        0.06

        0.06

        0.006

        5.5

        1.3

        1.0

        0.08

        0.08

        0.008

        6.8

        1.7

        1.25

        0.1

        0.1

        0.010

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