定量SDS凝胶染色与扫描

设备

SDS-PAGE 电泳装置

凝胶扫描装置

试剂

考马斯亮蓝（CBB) 染色液

脱色液

(配方，见“试剂的配制”，PP.184~189)

操作程序

1) 小心地在 SDS 凝胶泳道上加一组按量递增为序的蛋白质样品，再按同样顺序加一组纯蛋白质样品作为定量的标准。按常规进行电泳（见附录 5)。

2) 从电泳装置取下凝胶，置于脱色液中漂洗 1 min 以脱去部分 SDS，再将它浸泡在 CBB 染色液中，于 20°C 缓慢摇动（如在脱色摇床上）。0.75-mm 厚的凝胶需浸泡 lh,1.5-mm 厚的凝胶约需 4 h。

3) 倾出 CBB 染色液，将凝胶浸泡在脱色液中，缓慢摇动1~4 h, 视凝胶厚度而定 (用海绵或 Kimwipe 纸巾吸收游离的染料)。当大部分染料由凝胶扩散出来后, 从容器中取出吸收物，于脱色液中加入 CBB 染色液，使其 A_650nm 值达 0.1(浅蓝色)。当时，CBB 的浓度大于它与蛋白质的平均结合系数。凝胶置于此稀染色液中平衡过夜，并保存于其中直至扫描测定。

4) 在 650nm 波长下，扫描经染色和脱色的凝胶，测定各蛋白带中结合染料的量。

5) 对每条带，以结合染料量对其加样量作图，比较所得直线与标准曲线的斜率, 计算各样品中目的蛋白的浓度。

6) 对原材料或纯化各步祥品的凝胶扫描全程进行积分，计算σ³² 带中的蛋白质占总蛋白量的比例。
注：此值是纯度的最大估计值。通常，在检测极限下还有许多条带，如将它们加在一起时就不能忽略了。多数研究者常高估他们的蛋白质制备物的纯度。