mRNA差异显示技术[mRNA differetial display]

1.概 述
mRNA差异显示技术（mRNA differetial display）是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。

方法建立：1992年 Liang P和Pardee首次应用DD技术对比人类乳腺癌细胞与正常细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因

目前已应用于个各领域：
农业、植物
动物
医学
• 胚胎发育
• 遗传病
• 药物
• 肿瘤

2.mRNA差异显示原理
是分离差异表达基因的一个重要方法。人类大约含有三万个不同的基因。在不同的单个细胞中只有10％的基因处于表达状态。
生物 体在不同的生理，病理状态下，基因的表达水平不同。
生命过程中选择性表达的基因主要有：发育与分化、体内平衡、对攻击的应答、细胞周期调节、老化和程序性细胞死亡等。
差异显示获得的只是某个基因的片段，而不是直接获得全长cDNA克隆。

3.基本程序
选择表型特性差异显著对象
展示mRNA的差异
基因差异
克隆与表型差异高度相关的新基因
4.技术
• 基本技术
逆转录（ RT ）
聚合酶链反应（PCR）
凝胶电泳
5.RT-PCR
• 锚定引物 T12-MN，含有12个T可以结合于mRNA 3`端 poly（A）尾，M为A、C、G 3种碱基之一，N为A、T、C、G 4种碱基之一。
• 荧光锚定引物 ，引物5`端加入T7 RNA多聚酶启动子并带有荧光分子

----------- AAAAAAAAAA –3` mRNA

------------XAAAAAAAAAAA–3` 1/3 mRNA
MTTTTTTTTTTTT（12T） Prime

---------YXAAAAAAAAAAAAA –3` 1/12 mRNA
NMTTTTTTTTTTTT（12T）Anchor Prime

•荧光锚定引物：
NMTTTTTTTTTTTT-T7 RNA多聚酶启动子-荧光分子
（Genomyx company）

因此共有12种锚定引物
• 同位素 标记锚定引物

•随机引物 （Arbitrary Prime）
可以随机地与cDNA不同位置多个位点结合，扩增出不同长度的cDNA片段混合物。
共20种随机引物，随机引物-M13
•随机和锚定引物的多种组合可以展示10000-15000种mRNA