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        聚合酶链反应-单链构象多态性分析

        互联网

        1752

         PCR-SSCP分析的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。PCR产物变性后,单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见,PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
          为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果,现已发展多种PCR-SSCP技术,各有其优势及适用领域。例如,可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷,也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时,利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增,使扩增产物带有同位素标记物,然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物,均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较,前者经济、扩增特异性强,多用于大样本的检测和筛选;后者操作简便,适于一般实验室开展,可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。
        一、 试剂 准备
        ⒈ PCR相关 试剂
        ⒉ α-32P-dCTP
        ⒊ 30%聚丙烯酰胺(29:1):丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g,溶于100ml ddH2O中,4 OC保存。
        ⒋ 10%过硫酸胺配制方法:1g 过硫酸胺,溶于10ml ddH2O中,4 OC保存(可用数周)。
        ⒌ TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
        ⒍ 5×TBE缓冲液:Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml,加ddH2O至1000ml。
        7.变性上样液:95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、 20mM EDTA(pH 8.0)
        二、操作步骤
        ⒈ PCR扩增
        反应总体积为10μl,在0.5ml微量 离心管 中加入下列反应成分:
        10×buffer   1μl
        dNTPmix    70μM
        DNA模板 100ng
        引物及Taq DNA酶 依实验设计要求按比例加入
        α-32P-dCTP   0.1μl
        加ddH2O至   10μl
        按实验设计循环参数进行扩增,获取扩增产物。

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