最新修订时间：2024-05-13
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来源：丁香实验
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![5|ul 10X T 4 多核苷酸激酶缓冲液； 5〜1〇4 Dy-32P] A T P (50〜lOOpCi); 2pl 5U / V T 4 多核苷酸激酶； 加水至50^x1。 37°C孵 （ 化）30〜60min。 在 65°C加热IOmin使酶失活（ 附录3E)。 P C R 的产物能直接被添加的O.ljuCi [Cr32P] d C T P 所标记，对于每个P C R 反应体 系，未被标记的正常使用的d C T P 减少1/1〇，凝胶也将可能被艮染。 2.准备一份20个反应的P C R 混 合 物 （ 总共96〇4): IOOjUl PCR 引物 A ; 100/xlPCR 引物 B ; IOOjLtl 2 mmol/L 4dNTP 混合物； lOOyl 1 0 X P C R 扩增缓冲液； 5U/juJ Tag DNA 聚合酶； 506/xl 水； 50pl标记引物混合物（ 第 1 步） 。 混合均勻，分装到20只管内，每管48^1，每管加入如1样本D N A (50〜50〇ng)。 再加入3 滴矿物油，调节好扩增用的合适的循环温度条件，如果可能的话，用—种已 知的正常个体的D N A 来控制反应。已知个体在靶序列中携带一个突变（ 单元7.1)。 P C R 的产物能直接被代替2jul 10mCi/ml [or32?] d C T P 和 4 4 4 水的50jlJ 标记 的引物混合物所标记。 3•证实扩增的靶序列分析，通 过 5〜IOjul的 P C R 产物，在 2 % 〜3 % 微型胶取得低胶 凝/熔点琼脂糖凝胶上。 4. 用洗涤剂、水和乙醇玻璃板彻底清洗。用 2 % 二甲基二氯硅烷处理一板：小心地用薄 膜与Kimwipes纸巾与二甲基二氯硅烧滋润，允许薄膜干燥，用乙醇擦拭。插人间隔 物，并封闭两边和底部防水胶带。 5. 准备凝胶的办法。 4. 5 % ( 0 . 4 m m 厚）nondenaturing聚丙烯酰胺凝胶，混合： 6. 3m l 5〇% (或者更高）聚丙烯酰胺储存液； 3. 5ml 1 0 X T B E 缓冲液； 59ml 水。 去除毒气，然后加Iml 1 0 % 的 A P S ，混合均匀，加 5 0 4 T E M E D ，再次混合均 匀。必要的话，加入 5 % 或 10% ( V / V ) 的甘油，混合凝胶，以改善实验方案，不 要使用变性剂，.如尿素。 6•立即灌胶，轻弹胶板赶走气泡，把梳齿插好，水平静置至少45m i n 以使其聚合。对 于鲨齿梳，应将齿向上插入，形成一个单一的、胶宽度的孔。 胶浓度的均匀是很重要的，在边缘和中间支撑垫平胶板，以确保胶的浓度均匀。 7•冷却胶， 0.5缓冲液储存于4°C 槽中。 8.从胶的底部移去夹子和胶带，移去梳齿。把胶板链接到测序仪上。对于鲨齿梳，用 向下的齿替换原来向上的齿，并使其刚好接触胶的表面。加 入 0 . 5 X T B E 到顶和底 的槽子中。用带针的注射器从胶的底部冲洗胶孔和气泡。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469689517089daphtxnnszpng_small.jpg)
