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通过单链构象多态性分析检测基因突变

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	人类基因组 DNA
试剂、试剂盒	Tag DNA 聚合酶低胶凝溶点琼脂糖 10 X TBE 缓冲液多核苷酸激酶和10 X 缓冲液二甲基二氯硅烷 EDTA 4dNTP 混合液 2 X 甲酰胺加载缓冲液过硫酸铵 10 X PCR 扩增缓冲液丙烯酰胺原溶液 PCR引物A和B 矿物油
仪器、耗材	水浴锅 U V 透明塑料带防水带 DNA 序列凝胶仪器滤纸循环变温加热器

步骤

1.标记P C R 引物A 和 B ，用如下方式混合（足量的20只 P C R 管）: 54 I O D 26q/ml PCR 引物 A ; 5jul I O D 260Anl PCR 引物 B ;

5|ul 10X T 4 多核苷酸激酶缓冲液； 5〜1〇4 Dy-32P] A T P (50〜lOOpCi); 2pl 5U / V T 4 多核苷酸激酶；加水至50^x1。 37°C孵（化）30〜60min。在 65°C加热IOmin使酶失活（附录3E)。 P C R 的产物能直接被添加的O.ljuCi [Cr32P] d C T P 所标记，对于每个P C R 反应体系，未被标记的正常使用的d C T P 减少1/1〇，凝胶也将可能被艮染。 2.准备一份20个反应的P C R 混合物（总共96〇4): IOOjUl PCR 引物 A ; 100/xlPCR 引物 B ; IOOjLtl 2 mmol/L 4dNTP 混合物； lOOyl 1 0 X P C R 扩增缓冲液； 5U/juJ Tag DNA 聚合酶； 506/xl 水； 50pl标记引物混合物（第 1 步）。混合均勻，分装到20只管内，每管48^1，每管加入如1样本D N A (50〜50〇ng)。再加入3 滴矿物油，调节好扩增用的合适的循环温度条件，如果可能的话，用—种已知的正常个体的D N A 来控制反应。已知个体在靶序列中携带一个突变（单元7.1)。 P C R 的产物能直接被代替2jul 10mCi/ml [or32?] d C T P 和 4 4 4 水的50jlJ 标记的引物混合物所标记。 3•证实扩增的靶序列分析，通过 5〜IOjul的 P C R 产物，在 2 % 〜3 % 微型胶取得低胶凝/熔点琼脂糖凝胶上。 4. 用洗涤剂、水和乙醇玻璃板彻底清洗。用 2 % 二甲基二氯硅烷处理一板：小心地用薄膜与Kimwipes纸巾与二甲基二氯硅烧滋润，允许薄膜干燥，用乙醇擦拭。插人间隔物，并封闭两边和底部防水胶带。 5. 准备凝胶的办法。 4. 5 % ( 0 . 4 m m 厚）nondenaturing聚丙烯酰胺凝胶，混合： 6. 3m l 5〇% (或者更高）聚丙烯酰胺储存液； 3. 5ml 1 0 X T B E 缓冲液； 59ml 水。去除毒气，然后加Iml 1 0 % 的 A P S ，混合均匀，加 5 0 4 T E M E D ，再次混合均匀。必要的话，加入 5 % 或 10% ( V / V ) 的甘油，混合凝胶，以改善实验方案，不要使用变性剂，.如尿素。 6•立即灌胶，轻弹胶板赶走气泡，把梳齿插好，水平静置至少45m i n 以使其聚合。对于鲨齿梳，应将齿向上插入，形成一个单一的、胶宽度的孔。胶浓度的均匀是很重要的，在边缘和中间支撑垫平胶板，以确保胶的浓度均匀。 7•冷却胶， 0.5缓冲液储存于4°C 槽中。 8.从胶的底部移去夹子和胶带，移去梳齿。把胶板链接到测序仪上。对于鲨齿梳，用向下的齿替换原来向上的齿，并使其刚好接触胶的表面。加入 0 . 5 X T B E 到顶和底的槽子中。用带针的注射器从胶的底部冲洗胶孔和气泡。

9. 用 0. SDS/10mmol/L E D T A (p H 8. 0 ) 将 P C R 产物稀释 10 倍。将 IOjul 稀释后的样品和2X 甲酰胺上样缓冲液混合。 90°C 加热3min。然后立即转移到冰上，以防止 D N A 链再退火。也可以在加热前，直接加两体积的甲酰胺上样缓冲液到完全的 P C R 混合物中，或者直接从90°C 加热模块加载P C R 样。 10. 立即加人2〜5^x1各种P C R 样品。其他泳道包括P C R 放大的阳性和阴性对照D N A 和非变性P C R 产物（用来指示胶上双链D N A 的位置）。电泳，溴酚蓝刚跑出胶的底端时停止。典型的是在30W ， 4°C 条件下电泳2〜4h ，也可以在低压（如 6W ) 室温下电泳过夜。含有甘油的胶一般电泳得更慢。含有 1 0 % 甘油的6% 的丙缔酰胺凝胶最适合在 6〜8 W 下电泳过夜。 11•电泳后，切断电源，将胶从仪器上取下来。把胶带从边上取下来，把胶放平。拆开胶板（胶应该粘在其中的一块板子上），把胶移到一张Whatman 3 M M 纸上，并用塑料罩盖好。在 80°C 凝胶干燥器中干燥45min。 12.室温下不用增强屏，放射自显影4h 到一夜。

来源：丁香实验

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