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        实验所用培养基和试剂

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        2399
        1、营养琼脂培养基
        成分:
        蛋白陈      10 g
        牛肉育      3 g
        氯化钠      5 g
        琼脂        15-20 g
        蒸馏水      1000 mL
        制法:
        将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15 %氢氧化钠溶液约2 mL校正pH至7.2-7.4,加入琼脂,加热煮沸使琼脂溶化,分装于烧瓶内,121 ℃高压灭菌15 min。
        注:此培养基可供一般细菌培养之用,可倾注平板或制成斜面。如用于菌落计数,琼脂量为1.5 %;如作成平板或斜面,则应2 %。

        2、乳糖胆盐发酵管
        成分:
        蛋白胨      10 g
        猪胆盐(或牛、羊胆盐)      5 g
        乳糖        10 g
        0.04 %溴甲酚紫水溶液       24 mL
        蒸馏水       1000 mL
        pH7.4
        制法:
        将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装每管10 mL,并放入一个小倒管,115 ℃高压灭菌15 min。
        注:双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。

        3、乳糖发酵管
        成分:
        蛋白胨      20 g
        乳糖        10 g
        蒸馏水       1000 mL
        0.04%溴甲酚紫水溶液       25 mL
        pH7.4
        制法:
        将蛋白陈及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,按检验要求分装每管30 mL、10 mL或3 mL,并放入一个小倒管,115 ℃高压灭菌15min。
        注:
        ①双料乳糖发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。
        ②30 mL和l0 mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用,3 mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。

        4、麦康凯琼脂
        成分:
        蛋白胨       17g
        朊胨       3 g
        猪胆盐(或牛、羊胆盐)      5 g
        氯化钠      5 g
        琼脂        17 g
        蒸馏水       1000 mL
        乳糖       10 g
        0.01 %结晶紫水溶液      10 mL
        0.5 %中性红水溶液      5 mL
        制法:
        ①将蛋白胨、朊胨、胆盐和氧化钠溶解于400 mL蒸馏水中,校正PH7.2,将琼脂加入600 mL蒸馏水中,加热溶解,将两液合并,分装于烧瓶内,121 ℃高压灭菌15 min备用。
        ②临用时加热熔化琼脂,趁热加入乳糖,冷至50 ℃一55 ℃时,加入结晶紫相中性红水溶液,摇匀后倾注平板。结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。

        5、伊红美蓝琼脂(EMB)
        成分:
        蛋白胨      10 g
        乳糖     10 g
        磷酸氢二钾     2 g
        琼脂      17 g
        2%伊红Y溶液      20 mL
        0.65%美蓝溶液     10 mL
        蒸馏水        1000 mL
        pH      7.1
        制法:
        将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中,校正pH,分装于烧瓶内,121 ℃高压灭菌15 min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂,冷至50 ℃一55 ℃,加入伊红和美蓝溶液,格摇匀,倾注平扳。
         
        6、三糖铁琼脂(TSI)
        成分:
        蛋白胨     20 g
        牛肉膏     5 g
        乳糖     10 g
        蔗糖      10 g
        葡萄糖     1 g
        氯化钠      5 g
        硫酸亚铁铵[Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O]     0.2 g
        硫代硫酸钠     0.2 g
        琼脂     12 g
        酚红     0.025 g
        蒸馏水     1000 mL
        pH7.4
        制法:
        将除琼脂和酌红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正pH,加入琼脂,加热煮沸,以溶化琼脂,加入0.2 %酚红水溶液12.5 mL,摇匀,分装于试管内,装量宜多些,以便得到较高的底层。l21 ℃高压灭菌15 min,放置高层斜面备用。

        7、克氏双糖铁琼脂(KI)
        上层培并基成分:
        血消化汤(pH7.6)     500 mL
        琼脂     6.5 g
        硫代硫酸纳      0.1 g
        硫酸亚铁铵     0.1 g
        乳糖     5 g
        0.3 %酚红溶液     5 mL
        下层培养基成分:
        血消化汤(pH7.6)     500 mL
        琼脂     2 g
        葡萄糖     1 g
        0.2%酚红镕液     5 mL
        制法:
        ①取血消化汤按上层和下层的琼脂用量,分别加入琼脂,加热溶解。
        ②分别加入其他各种成分。将上层培养基分装于烧瓶内;将下层培养茬分装于灭菌12 mm×100 mm试管内,每管约2 mL。115 ℃高压灭菌10min。
        ③将上层培养基放在56 ℃水浴箱内保温;将下层培养基直立放在室温内.使其凝固。
        ④待下层培养基凝固后,以无菌操作将上层培养基分装于下层培养基的上面,每管约1.5mL,放成斜面。

        8、半固体琼脂
        成分:
        蛋白胨     10 g
        牛肉膏     3 g
        氯化钠    5 g
        琼脂     4 g
        蒸馏水     1000 mL
        pH7.5
        制法:
        按以上成分配好,煮沸使溶解,并校正pH7.4-7.6加入琼脂后趁热过滤(若琼脂无杂质可不过滤),分装、包扎、标记,121 ℃灭菌15 min,取出直立凝固备用。
        注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异等试验用。

        9、Honda氏产毒肉汤
        成分:
        水解酪蛋白      20 g
        酵母浸膏粉     10 g
        氯化钠     2.5 g
        磷酸氢二钠      15 g
        葡萄糖     5 g
        微量元素     0.5 g
        蒸馏水     1000 mL
        pH7.5
        制法:
        溶解后校正pH,121 ℃高压灭菌15 min,待冷却至45-50 ℃时,加入林可霉素溶液(每毫升培养基内含90 μg)。微量元素配方:硫酸镁5 g、氯化铁0.5 g、氯化钴2 g、蒸馏水100 mL。

        10、E1ek氏培养基(毒素测定用)
        成分:
        蛋白胨     20 g
        麦芽糖      3 g
        乳糖     0.7 g
        氯化钠     5 g
        琼脂     15 g
        40 %氢氧化钠溶液     1.5 mL
        蒸馏水     1000 mL
        pH7.8
        制法:
        用500 mL蒸馏水溶解琼脂以外的成分,煮沸,并用滤纸过滤,用1 moL/L氢氧化钠校正pH;用另外500 mL蒸馏水加热溶解琼脂,将两液混合,分装于试管内,每管10 mL或20 mL,121 ℃高压灭菌15 min。临用时加热溶化琼脂,倾注平板。

        11、肠道菌增菌液肉汤
        成分:
        蛋白胨    10 g
        牛胆盐    20 g
        葡萄糖    5 g
        磷酸氢二钠     8 g
        磷酸二氢钾     2 g
        煌绿     0.015 g
        蒸馏水      1000 mL
        pH7.2
        制法:
        将上述成分配好,加热溶解,校正pH,分装每瓶30 mL在115 ℃高压灭菌15 min。

        12、营养肉汤
        成分:
        蛋白胨    10 g
        牛肉膏    3 g
        氯化钠     5 g
        蒸馏水     1000 mL
        pH7.4
        制法:
        按上述成分混合,溶解后校正pH,分装烧瓶,每瓶225 mL,121 ℃高压灭菌15 min。

        13、糖发酵管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)
        成分:
        牛肉膏      5 g
        蛋白胨      10 g
        氯化钠     3 g
        磷酸氢二钠      2 g
        0.2 %溴麝香草酚蓝溶液     12 mL
        蒸馏水     1000 mL
        pH7.4
        制法:
        葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5 %加入葡萄糖,分装于有一个倒置的小试管内,121 ℃高压灭菌15 min。其他各种糖发酵管可按上述分配好后,分装每瓶100 mL,121 ℃高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10 %溶液,同时高压灭菌。用无菌吸管将5mL糖溶液加入于100 mL培养基内,以无菌操作分装试管。
        实验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36±1 ℃培养。一般观察2-3天,迟缓反应观察14-30天。

        14、尿素琼脂
        成分:
        蛋白胨     1 g
        氯化钠      5 g
        葡萄糖     1 g
        磷酸二氢钾      2 g
        琼脂      20 g
        0.4 %酚红溶液     3 mL
        20 %尿素溶液     100 mL
        蒸馏水     900 mL
        pH7.2±1
        制法:
        将除尿素和琼脂以外的成分配好,并校正pH,加入琼脂,加热溶化并分装烧瓶。121 ℃高压灭菌15 min,冷至50-55 ℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2 %,最终pH应为7.2±1,分装于灭菌试管内,放斜面备用。
        试验方法:挑取琼脂培养物接种,在36±1 ℃培养24 h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色

        15、氰化钾培养基
        成分:
        蛋白胨     10 g
        氯化钠      5 g
        磷酸二氢钾      0.225 g
        磷酸氢二钠      5.64 g
        琼脂      20 g
        0.5 %氰化钾溶液     20 mL
        蒸馏水     1000 mL
        pH7.6
        制法:
        将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶,121℃高压灭菌 15 分钟放在冰箱内使其充分冷却,每100 mL培养基加入0.5 % 氰化钾溶液2.0 mL(最后浓度为 1:1000),分装于12 x100 mm 灭菌试管。每管约4mL, 立即用灭菌橡皮塞塞紧,放在4 ℃冰箱内, 至少可保存两个月。同时, 将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
        试验方法: 将琼脂培养物接种于蛋白陈水内成为稀释菌液,挑取一环接种于KCN培养基, 并另挑取一环接种于对照培养基。于36士1 ℃培养1-2天, 观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2天细菌不生长为阴性(抑制)。
        〈注〉氰化钾是剧毒药物,使用时应小心, 以免中毒, 夏天分装培养基应在冰箱内进行。 试验失败的原因主要是封口不严, 氰化钾还渐分解产生氢氨酸气体逸出,以致药物浓度降低细菌生长, 因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。

        16、氧化酶试验
        试剂:
        1 % 盐酸二甲基对苯二胺溶液, 少量新鲜配制, 于冰箱内避光保存。
        1 %α一萘酚酒精溶液。
        试验方法 :
        取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲苯对二胺溶液一滴。阴性者呈现粉红色, 并逐渐加深;再加α一萘酚溶液一滴。阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。以毛细吸管吸取试剂, 直接滴加于菌落上, 其显色反应与以上相同。

        17、靛基质试剂
        柯凡克试剂:
        将5 g对二甲氨苯甲醛溶解于 75 mL 戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。
        欧-波试剂:
        将1 g对二甲氨基苯甲醛溶解于95 %乙醇95 mL内。然后缓慢加入浓盐酸2O mL。
        试验方法:
        挑取小量培养物接种,在(36±1) ℃培养1-2 d, 必要时可培养4-5 d。加入柯凡克试剂约 0.5 mL, 轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5 mL, 沿管壁流下,覆 盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
        注:蛋白胨应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后 , 应先用已知菌种鉴定后方可使用。
         
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