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        PCR 引物设计的原则和要点

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        引物设计有3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应。

        引物设计应注意如下要点:

        1.  引物的长度一般为15~30 bp,常用的是18~27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

        2.  引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。

        3.  引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。

        4.  引物序列的GC 含量一般为40~60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

        5.  引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。

        6.   ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。

        7.  引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

        8.  对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
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